AAT荧光染料标记蛋白常见问题解答
AAT荧光染料相关问题
1、AAT荧光染料与传统染料相比有何优势？
iFluor系列染料与传统染料如 Cy3 Cy5 Cy7（from GE）相比水溶性好稳定性高PH不敏感、亮度高、价格低、背景值低，可以完美替代。
2、抗体标记的原理是什么？
对于iFluor系列的 SE（琥珀酰亚胺酯）染料，SE与抗体的氨基反应生产稳定的酰胺键；而对于APC、PE、HRP等大蛋白分子，预活化好的FOL的大蛋白，与需要连接在抗体上的MTA特异性结合。
3、标记好的抗体4度条件下可以储存多久？
标记好的抗体当浓度大于等于1mg/ml，4度可储存一年，当抗体浓度在0.1-0.5mg/ml时，可以加入0.2%BSA保存。
4、染料的保质期是多久？
在产品备注的储存温度条件下，以开封日起可存放一年。PS:DMSO 溶液不是很稳定，需要无水 DMSO，避免冻融循环。
5、标记的抗体或者蛋白大小有要求吗？
建议不要小于20KD
6、有哪些抗体不适合用于标记？
不适合包含牛白蛋白血清（BSA），明胶，游离氨基酸(L-组氨酸)或铵盐的抗体或蛋白质。
7、去除叠氮化钠、硫酸铵或醋酸铵等这些杂质成分用什么？
只需要Cat#60502 spin filter一个柱子可去掉所有的这些杂质。
8、在标记大蛋白使用的MTA，必须搭配使用MTA清除剂使用吗？
可以不用，因为这个group细胞里是没有的。
9、 一抗抗体上可以结合几个荧光素？不同抗体会不会链接上的荧光数量不同？
相同条件不会连的荧光数量不同，一般在2-4之间，不同的荧光染料略有不同。DOS＞４以后亮度增加不多，会更亮一些，但背景值可能会增加。对于不易淬灭的荧光可以标记到6。
10、标记的效率如何检测？
iFluor 的标记我们是测纯化后的dye/protein ratio，也有客户用 Run SDS Gel的方法。
Buccutite的效率我们是用SEC的column来测的。
11、iFluor系列染料标记蛋白会不会影响被标记蛋白和别的蛋白的相互作用？
不会
12、AAT市售的抗体不同应用的抗体推荐稀释比是多少？
Western Blot (WB): 1µg/ml，Immunofluorescence (IF): 2-10 µg/mL ，Flow Cytometry (Flow): 2-10 µg/mL
13、用AAT荧光标记的抗体更亮的原因是什么？
结构不同，在于荧光做了修饰，容易链接到抗体上而不易发生淬灭，比如一个抗体IF594能标4-6个，而AF594只有2-3个。
14、染料和蛋白的比例大概是多少？
大约摩尔比为1：15，在抗体浓度是1mg/ml时。
15、最常见的succinimidyl ester（琥珀酰亚胺酯）和Maleimide活性集团结合在抗体的什么部位？
SE跟抗体的-NH2连接形成类似于肽键的结构，从而连接到抗体上，这是最简便的连接方式；Maleimide活性基团与巯基（-SH）结合，优点是只标记抗体Fc片段不会影响抗原抗体的结合部位。
16、抗体标记DPR值(抗体和荧光蛋白的比例)的参考范围有没有推荐？
这个与抗体和dye的比例有关，也与抗体的浓度有关，请参考不同染料的说明书，里面有建议的比例。
17、标记过后用什么柱子纯化？
货号为60500的柱子纯化。
18、AAT iFluor荧光染料是否有自己的专利？我使用iFluor在自己的产品上时是否需要支付版权费用？
我们可以提供专利证明文件。从达科为购买AAT荧光染料，无需支付版权费。
19、MTA和FOL组合与SMCC标记大蛋白方法的最大优势是什么？
交联剂的一端（通过NHS酯）与氨基酸赖氨酸和N-末端中发现的胺（-NH2）反应，另一端（通过马来酰亚胺）与氨基酸中发现的硫醇基团（-SH）反应半胱氨酸。然而，SMCC修饰的蛋白质极不稳定并且通常是自身反应性的，因为蛋白质通常含有胺和硫醇基团，其引起显着量的自交联。
操作简单的抗体标记试剂盒问题
20、我的抗体中含有甘油可以用抗体标记试剂盒吗？
甘油最好20% 以下
21、iFluor系列抗体标记试剂盒中的淬灭剂为什么可以淬灭掉没连接在抗体上的荧光，而标记在抗体上的荧光却不会被淬灭？
因为淬灭剂和未结合上的荧光是分子内的淬灭，而连在抗体上的荧光，是分子间的淬灭，只有很高浓度才会被淬灭。
22、抗体标记试剂盒的淬灭剂的成分是什么，可以单独购买吗？
淬灭剂是一种小分子，可以单独购买，货号为“标记试剂盒货号+C”，例如1255C。
23、抗体标记试剂盒的淬灭剂可以淬灭APC、PE 这种大蛋白吗？
不推荐，建议使用60500柱子纯化。
24、我要做体内实验担心抗体标记试剂盒中的淬灭剂会影响实验怎么办。
1）不加淬灭剂，加10mM Glycine buffer 可以， 这样dye 就没有活性了。
2）可以用10K filter把小分子的dye 除去。
https://www.aatbio.com/products/readiuse-10kd-spin-filter?unit=60502
25、iFluor系列染料和Buccutite试剂盒，标记蛋白或抗体的效率分别是多少呢？
iFluor 的标记是全标记上了，但是Buccutite的效率应该在80%以上。
26、Readlink试剂盒的reaction buffer成分是什么？
可以用1.0M NaHCO3 buffer or Phosphate buffer (pH=8.5)来调pH
27、iFluor系列抗体标记盒，我每次标记不了50ug，每次标记可不可以小于50ug？
可以小于50ug, dye用DMSO溶，等比例减少用量， 但是剩下的dye量很少，可能不太稳定。
28、如果我的抗体含有少量的BSA，是否可以使用抗体标记试剂盒？
可以，我们有BSA兼容的ReadiLink™ xtra 系列抗体标记试剂盒，但是BSA的含量要在0.5%以内的标记效果是最好的。
番 外：
1. 关于60502 这个产品的用法很灵活，主要有以下三方面的用途：
1）Concentrate volume （浓缩）
2）Desalting （除盐，或除去小分子）
3）Deproteinization of biological samples （除蛋白）
从第二个用途来说和60500柱的用途是一样的。但是推荐用60500，会除小分子更快更干净一些。
2. 标记大蛋白SMCC方法简要步骤： APC/SMCC和抗体/DTT分别过柱子,混合,封闭,浓缩,检测。APC在标记前需要过柱子成PBS缓冲液；SMCC现用现配。
3. IgG的大小是150Kd
4.不同染料对比数据
5. 不同染料基本信息
6. 工业客户推荐简要的“原汁原味”Protocol实例
1) iFluor594, NHS, 1mg/vial, add 100uL anhydrous DMSO to prepare 10mg/ml solution.
2) Prepare Antibody 5mg/ml in PBS, 100uL
3) Add 5ul 1.0M NaHCO3 (pH=8.5-9.0) to adjust pH to 8.5-9.0
4) Add 3.9uL 10mg/ml iFluor594, SE stock solution (10X labeling ratio)
5) Mix well, incubate at room temperature for 60min
6) Set up Spin column (Cat#60500), equilibrate column with PBS buffer
7) Collect elution
8) Measure Absorbance A280nm and A594nm
https://www.aatbio.com/tools/degree-of-labeling-calculator
Target DOS >4
9) If DOS is lower than 4, need to add iFluor594, SE and relabel the conjugate until it reaches the target DOS.
7. 10mg/ml 每次标记20mg抗体实例
1) 10mg/ml in PBS, 2mL, Add 100uL reaction buffer to adjust pH
2) Dissolve iFluor488, SE in DMSO to make 10mg/ml
3) Add 8 eq. mole iFluor488, SE to IgG solution
4) Reaction for 60min
5) Pack 2 PD-10 columns (10mL gel/column)
6) Load 1mL reaction mixture,
7) Spin to purify the mixture
8) Collect the purified IgG-iF488 conjugate.
PD-10珠子的材料是聚丙烯酰胺，建议纯化1500以下的小分子与分子量大于15，000以上的蛋白。
