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您想了解的Strep-tag:Strep-Tactin®XT发展史都在这里!

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20190618 打印 字体:  
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有用过His-tag进行蛋白纯化的人,或多或少都有这样的经验 : 蛋白纯度低、纯化出来的蛋白失去原有结构或功能受到影响、难以从哺乳类细胞表达系统中纯化出目标蛋白…等,因此科学家开始尝试以不同亲和标签进行蛋白纯化。因为Strep-tag系统的纯化过程温和、目标蛋白纯度高,且相容于多种表达系统的特性,愈来愈受到大众的欢迎。但是,你知道Strep-tag这个纯化系统是怎么发展而来的吗? 这得从功能性抗体开始说起…

功能性抗体的出现


随着生物制药技术的发展,抗体也因此成为科学家研究的热门领域。但在80年代初,功能性抗体的表达一直是个问题,酵母表达系统中表达出来的蛋白只有部分具有功能,在其他的微生物表达系统中,也没有成功的先例。一直到80年代末,一个具有功能性的McPC603抗体的Fv片段终于成功的在E. coli中被表达出来1。这一方法的出现,使得科学家能更快速的表达具有不同基因变异的抗体片段,并能对这些变异所引发的功能改变进行检视。

抗体纯化没有想象中那么简单

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将重组抗体片段表达出来之后,必须将此片段纯化出来,当时多以亲和层析法搭配目标抗体的抗血清(antiserum)进行蛋白纯化,

但这一方法常常受到限制 : 在研究一个未知目标蛋白时,常出现没有抗血清或是相容抗体的情况,这严重影响了实验进度。为此,科学家尝试找出更有效的一步纯化法。首先,他们考虑在重组蛋白上加入短肽标签(tag),当时市面上已有myc、flag、KT3 epitope等标签,但这些主要适用于侦测目标蛋白,纯化蛋白效果非常有限,或非常昂贵。

随着His-tag的问世,让固定化金属离子亲合层析法(Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC)纯化目标蛋白变为可能,这的确提高了蛋白纯化的效率。

但是His-tag仅适用于纯化,无法用于侦测目标蛋白,而且使用His-tag进行Fv片段纯化时,高盐浓度常使得Fv片段解离成两个单体(VL及VH),难以保持抗体的功能性及正确结构 2

更高能的短肽标签呼之欲出

要解决这些问题,科学家需要找出一个具备以下功能的短肽签。


1.能被融合到目标蛋白上,且不会影响蛋白功能

2.能直接以现有试剂侦测出来

3.与配体的结合稳定、特异性高且容易控制。

经过一番搜索,发现链霉亲和素(Streptavidin)在特定情况下,能与不同短肽进行可逆性的结合,再加上其与生物素(biotin)极高的亲合力,且与背景蛋白的非特异性结合机率低,链霉亲和素已被应用在许多检测系统中,甚至能做为一个稳定的介质来固定蛋白。另外,链霉亲和素在不同溶液条件中稳定性好,较抗体来的高,所以能够重复被利用。因此,90年代初,科学家开始寻找一个能与链霉亲和素特异性结合的亲和标签2

终于找到了第一代Strep-tag系统 : Strep-tag vs Streptavidin

因先前已知可用E.coli系统表达出具有功能性的Fv片段1,科学家又希望能确认标签是否会影响蛋白功能,所以选择了已知的D1.3抗体Fv片段做为实验模型,以便检测加上的短肽标签是否影响了这片段与其抗原结合的特性3。接着,一连串能与链霉亲和素结合的标签被接到VH domain上,大量筛选之后,得到了一个适用于进行一步纯化的Strep-tag (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly) 3,与生物素相比,Strep-tag和链霉亲和素间的亲和力较低,因此可以使用生物素衍生物Diaminobiotin,在生理条件下进行温和洗脱。又因整个纯化流程温合,含盐浓度低,纯化出来的 Fv片段完整且功能不受影响3。除此之外,这个标签还能被应用在Western blot或ELISA实验中,以链霉亲和素酶偶联物(Streptavidin-enzyme conjugates)来检测纯化出的Fv片段。后续也测试了以Strep-tag来纯化抗体以外蛋白的可能性,证实了这个一步纯化系统可以被广泛使用在不同类型的蛋白上3

因为不完美,所以有了第二代 : Strep-tag II vs Strep-Tactin®


但Strep-tag仅能接在目标蛋白的C端,对于需将标签接在N端或是蛋白内部的实验,非常的不实用。因此科学家进一步优化了这个标签,便有了现在被广泛使用的Strep-tag II (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)4。但即便足以用于蛋白纯化,科学家对Strep-tag II与链霉亲和素的结合强度低这点仍不甚满意,因为在比较特殊的纯化条件中效率会受影响。于是进行了链霉亲和素的改造,发展出Strep-Tactin®。Strep-Tactin®:Strep-tag II的亲和力较Streptavidin:Strep-tag II提升了近100倍,这个改变使得洗脱时需改用脱硫生物素(Desthiobiotin) 5,但过程一样温合。这就是二代Strep-tag系统,在过去近20年间,逐渐被广泛应用于纯化或侦测蛋白质中,甚至发展出细胞分离检测的方6

总觉得还能更好,一起看看第三代 : Twin-Strep-tag vs Strep-Tactin®XT

即便亲和力已提升,在某些状况下,Strep-Tactin®使用仍有所限制,尤其是在需要极高亲和力的应用之中,例如检测蛋白质间的交互作用、或是从目标蛋白浓度低的样本中进行纯化。因此科学家利用总结合力(Avidity)的原理,将两个Strep-tag II以Linker连接在一起 :  Twin-Strep-tag 7。这一新标签的出现再度提升了目标蛋白与Strep-Tactin®的链接强度,改善了低浓度样本纯化效果8,还能用于抓取蛋白复合体、检测蛋白间的交互作用7, 9

美中不足的是,Strep-Tactin®在变性条件下并不稳定(例如:使用尿素时),无法进行纯化,且进行批量纯化时,即使搭配Twin-Strep-tag,效果仍有改善的空间。为此,科学家再次改造了Strep-Tactin®,得到与Twin-Strep-tag亲和力更上一层楼的Strep-Tactin®XT (XT意指extreme tight) 10。经过这次的优化,科学家首次创造出一个纯化系统,其中标签与配体的键结力几近共价,但链结仍保持可逆 (注:Strep-tag II也能与Strep-Tactin®XT结合)。因亲和力的增加,即使经过多次清洗步骤,蛋白也不会从Strep-Tactin®XT上解离,提高了目标蛋白的得率。需注意的是,洗脱步骤必须使用生物素,但是整个纯化流程与前几代一样温合,纯度超过95%,这就是 新一代Strep-tag系统。用Strep-Tactin®XT来纯化时,得率及纯度都提高;且Twin-Strep-tag搭配后还能用在Biacore芯片11, 12、微量滴定板或ELISA中来固定蛋白,进行后续检测,是一个多用途的亲和标签系统。

心动不如行动,快来体验Strep-tag纯化系统

产品介绍请见https://www.iba-lifesciences.com/lp-streptactinxt-cn.html

Strep-tag与His-tag系统的比较

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参考文献

1. Skerra A & Plückthun A (1988) Science, 240, 1038-1041.

2. Schmidt TGM & Skerra A (1993) Protein Eng., 6, 109-122.

3. Schmidt TG & Skerra A (1994) J Chromatogr A., 676, 337-45.

4. Schmidt TG, Koepke J, Frank R & Skerra A (1996) J Mol Biol., 255, 753-66.

5. Voss A & Skerra  (1997) Protein Eng., 10, 975-82.

6. Knabel M, Franz TJ, Schiemann M, Wulf A, Villmow B, Schmidt B, Bernhard H, Wagner H & Busch DH (2002) Nat Med., 8, 631-7

7. Junttila MR, Saarinen S, Schmidt T, Kast J, Westermarck J (2005) Proteomics, 5, 1199-203.

8. Schmidt TG, Batz L, Bonet L, Carl U, Holzapfel G, Kiem K, Matulewicz K, Niermeier D, Schuchardt I & Stanar K (2013) Protein Expr Purif., 92, 54-61.

9. Ivanov KI, Bašić M, Varjosalo M & Mäkinen K (2014) JoVE, 86, 51536.

10. Carl U (2016) Poster session presented at: PEGS Bosten 2016.

11. Dintner S, Heermann R, Fang C, Jung K & Gebhard S (2014) J Biol Chem., 289, 27899-910.

12. Yeliseev A, Zoubak L, Schmidt TGM (2017). Protein Expr Purif., 131, 109-118.

IBA Lifesciences公司简介

IBA Lifesciences(德国)是后基因组时代表达克隆和蛋白质纯化技术 重要的供应商之一。该公司的产品线分成三部分:一是开发了Strep-tag®的通用技术平台,可快速、多样性地生产、纯化和使用重组蛋白;二是细胞分选与扩增产品组合;三是定制化核酸合成服务。

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