【文献分享】泛组蛋白脱乙酰基酶抑制剂可增强实体瘤中B7-H3特异性CAR T细胞的抗肿瘤活性

引导语：

2021年6月23日，中国首款CAR T药-阿基仑赛注射液获得国家药品监督管理局批准上市。这是一种自体免疫细胞注射剂，由携带CD19 CAR基因的逆转录病毒载体进行基因修饰的自体靶向人CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR T）制备，用于治疗既往接受二线或以上系统性治疗后复发或难治性大B细胞淋巴瘤成人患者，这将开启中国肿瘤细胞治疗的新未来。

CAR T技术出现了多年并经历了诸多改进才逐渐进入临床，除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，改进后也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心脏病等疾病。近年来，国内外已经有很多关于CAR T细胞的研究和报导。2021年4月2日，在期刊Clinical Cancer Research（影响因子IF=10.107）发表了一篇标题为“A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-Specific CAR T Cells in Solid Tumors”的论文，研究泛组蛋白脱乙酰基酶抑制剂对实体瘤中B7-H3.CAR T细胞的抗肿瘤活性的影响。

接下来小编就给大家介绍一下这篇高分文献。

一、B7-H3在实体癌细胞上的表达及其与多种实体癌患者生存率的关系

B7-H3，也称为CD276，它是一种免疫检查点分子，属于免疫检查点抑制剂B7超家族。它的生物学特性功能目前尚不清楚，它的功能是共刺激或者共抑制分子取决于它所参与的免疫反应。在这篇文章，作者为了测试表观遗传疗法是否可以增强 B7-H3.CAR T细胞对多种实体癌类型的抗肿瘤活性，通过in vitro和ex vitro实验，评估了B7-H3.CAR T 细胞和脱乙酰酶抑制剂 (SAHA) 联合治疗几种实体癌的疗效和潜在机制。结果发现B7-H3 在大多数人实体瘤样本中会表达，但在正常组织中表达受限，B7-H3.CAR T 细胞在体外选择性杀死表达 B7-H3 的人癌细胞系。

作者采用中山纪念医院和中山大学自2007年4月至2013年12月期间收集的186例三阴性乳腺癌（TNBC）样本，298例头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）标本样本，152个非小细胞肺癌（NSCLC）样本和89例皮肤黑色素瘤（SKCM）样本用于B7-H3染色和分析。另外，采用中山纪念医院和中山大学自2016年5月至2018年11月期间收集的47例头颈部鳞状细胞癌样本和39例三阴性乳腺癌样本建立病人来源的异种移植模型。采用50ml健康献血者的外周血，以及70ml头颈部鳞状细胞癌患者和三阴性乳腺癌患者的外周血建立这两种癌症细胞系，建议TNBC-S3和HNSCC-Y2细胞系，以产生CAR T细胞。

首先，作者评估了B7-H3在实体癌和正常组织中的表达。如图1所示，B7-H3广泛表达于多种实体癌，但在正常组织有限表达。低表达B7-H3的TNBC，HNSCC，以及SCLC癌症患者的存活率更长。B7-H3表达升高与肿瘤患者的短存活率有关。因此，B7-H3不仅是实体癌的一个预后生物标志物，而且是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点。

图1：B7-H3在实体癌细胞上的表达及其与多种实体癌患者生存率的关系。图片来源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

二、脱乙酰酶抑制剂 (SAHA)可显著增加多种人实体癌细胞的B7-H3的表达

实体瘤中的抗原异质性是CAR T细胞的免疫治疗的主要障碍之一。抗原丰富区域促进了CAR T细胞的招募以及CAR T细胞和靶细胞之间的相互作用。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂已经被证明可以有效的上调转录激活。因此，作者检测了组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是否能增强B7-H3在实体癌细胞中的表达。如图2。考虑到剂量限制毒性和其他临床试验中观察到的与组蛋白脱乙酰基酶抑制剂相关的不良反应，作者筛选了一系列的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，结果发现SAHA可以最有效的上调B7-H3的表达，如0.5 mmol/L的SAHA可以诱导B7-H3表达水平上调两倍，并且SAHA可以上调B7-H3转录和蛋白水平。同时检测了B7-H3在经SAHA处理的多种正常人细胞上的表达，包括原代舌肌细胞，原代胃上皮细胞细胞，原代十二指肠细胞，原代肝细胞，原代胰腺细胞和原代卵巢细胞，发现SAHA没有增加B7-H3在人类正常细胞表面的表达。

图2：SAHA通过组蛋白修饰显著增加了多种人实体癌B7-H3的表达。图片来源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

三、SAHA可显著增强实体瘤细胞共培养的B7-H3. CAR T细胞的特异性细胞毒性

如图3，相比于未预处理的癌细胞，SAHA预处理的CAR T细胞共培养的癌细胞，经过24小时的孵育后，细胞上清中四种细胞因子：GMCSF，IFNγ，IL2和TNFα显著增加。说明SAHA可增强实体癌细胞对B7-H3.CAR T细胞的敏感性，并增强B7-H3.CAR T细胞在共培养体系中的细胞毒活性。

图3：SAHA可增强实体癌细胞对B7-H3.CAR T细胞的敏感性，并增强B7-H3.CAR T细胞在共培养体系中的细胞毒活性。图片来源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

四、SAHA可抑制B7-H3.CAR T免疫抑制信号通路以及增强蛋白质转运信号通路

作者进行mRNA分析以检测B7-H3.CAR T细胞转录组在SAHA处理下的变化。如图4，SAHA显著改变了转录组，有6172个基因表达显著上调，6225个基因表达显著下调。然后，采用基因富集分析去鉴定CAR T改变的细胞表型，发现与蛋白质运输相关的基因上调，而与免疫抑制和未折叠蛋白质反应相关的基因下调。

甲基胞嘧啶二氧酶（TET2）在最近的研究中证明可以有效调节CD19.CAR T细胞。因此，作者研究了TET2的潜在作用。如图4 E–I，敲除B7-H3.CAR T细胞的TET2后，CAR T细胞释放的四种细胞因子GM-CSF，IFN-γ，IL-2, TNF-α增多，细胞的毒性活性增加，释放的穿孔素和颗粒酶B也增多。因此，SAHA可以通过上调蛋白转运信号通路增加T细胞表面B7-H3.CAR的表达。此外，SAHA还会影响B7-H3.CAR T细胞中细胞毒性机制的关键成分TET2。

图4：SAHA上调蛋白质转运信号通路和减少免疫抑制分子的表达，例如CTLA-4和TET2，图片来源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors

五、SAHA可增强异种移植模型中B7-H3.CAR T细胞的抗肿瘤活性

作者用体内实验测试SAHA和B7-H3联合治疗，首先建立第0代（P0）小鼠原位细胞系。如图5，在CAR T细胞注入后的第30天，联合治疗显著控制了肿瘤的生长，联合治疗组的凋亡癌细胞百分比、B7-H3表达水平和肿瘤浸润T细胞数也最高，在SAHA和B7-H3.CAR T细胞治疗组中也发现了比其他组更具浸润性的生成IFNγ的T细胞。

图5：SAHA和B7-H3联合的CAR-T细胞在TNBC和HNSCC异种移植小鼠模型中表现出良好的肿瘤控制作用。图片来源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

六、结论

综上所述，作者从人源化mab 8H9中获得B7-H3.CAR T细胞，筛选了组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，发现SAHA介导可以上调B7-H3在实体癌细胞中的表达以及B7-H3.CAR T细胞在人T细胞中的表达。SAHA和B7-H3.CAR T细胞的联合后对多种类型的人实体癌的抗肿瘤活性增加。

重头戏来了!

在这篇高分文献中，作者在异体移植模型中分析肿瘤浸润性的生产IFNγ的T细胞，采用的是酶联免疫斑点法去定量生产IFNγ的T细胞。采用的试剂盒是达科为的达优系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit（cat#2110001和cat# 2110005），如下图。

 

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参考文献：

Lei, Xinyuan, et al. A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3–Specific CAR T Cells in Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 2021.

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