您好,欢迎光临达科为生物城!
免费热线电话 : 400 819 7199 收藏达科为生物城
当前位置: 首页 > 技术天地 > 技术专栏 > 蛋白纯化 > 正文

哺乳动物细胞表达系统中,关于蛋白纯化的难点和解决方案,了解一下!

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20190614 打印 字体:  
分享到:

先前小达君给大家介绍了Strep-tag® 的历史(点此回顾您想了解的Strep-tag:Strep-Tactin®XT发展史都在这里!),现在再隆重介绍 Strep-tag® 在哺乳类细胞表达系统的应用。另外,小达君保证您看完后会心动,然后回来参加活动(点此参加分享IBA蛋白纯化体验,获赠蛋白纯化填料哦!),获赠蛋白纯化填料哦!

虽然大肠杆菌E.coli表达系统经济实惠,但由于缺乏重要的脂类,分子螫合物,以及重要的翻译后修饰,用它表达真核蛋白,可能会影响蛋白本身的折叠及功能,以膜蛋白为例,大肠杆菌表达系统能影响目标蛋白在细胞膜的插入位置及其应有的功能[1]。除此之外,当目标蛋白大于50kDa时,使用大肠杆菌系统可能表达出不完整的蛋白[2]

所以,为了研究特定蛋白的功能(如:信号通路),生产较大型的蛋白,或进行高解析度的结构分析,愈来愈多的实验室选择哺乳类表达系统来生产融合蛋白。其原因为哺乳动物细胞生产出的重组蛋白与人类蛋白十分相似,有较完整的蛋白折叠、组合及翻译后修饰[3]。因此,愈来愈多科学家们更加关注于—如何从哺乳类细胞中高效的纯化目标蛋白。

1.亲和标签的选择

首先,需考虑选择合适的亲和标签。常用于哺乳动物表达系统的亲和标签有His-tag、FLAG-tag、GST-tag及Strep-tag®等[4-12],整理于下表:

亲和标签

氨基酸数量

配体

平衡解离常数(Kd) 范围

洗脱方式

一步骤
纯化纯度

His-tag

2-10,

多为6

Ni2+-NTA, 
Co
2+-CMA

nM

Imidazole 20–250 mM或low pH

*

FLAG-tag,

3x FLAG

8,

22

抗Flag抗体

nM

pH 3.0;2–5 mM EDTA或FLAG短肽

***

Glutathione S-transferase (GST-tag)

211

Glutathione

nM

5–10 mM reduced glutathione

**

Strep-tag®II (ST),

Twin-Strep-tag® (TST)

8,

28

Strep-Tactin®

nM (with TST)

2.5 mM desthiobiotin

***

Strep-Tactin®XT

pM (with TST)

50 mM biotin

***

*这些亲和标签在使用上各有千秋。

使用His-tag时,常遇到的问题是寄主蛋白与填料的非特异性结合,在哺乳动物重组蛋白的纯化过程中,这样的情况更为明显。由于系统中有很多含有组氨酸(histidine)的残基的蛋白,这种蛋白结构与his-tag相似,容易与镍柱结合,因此导致目标蛋白纯度降低[13]

FLAG-tag系统可在非变性条件下进行纯化,能得到高纯度、有活性的蛋白,但其缺点为纯化介质较为不稳定,且纯化成本高上许多[5]

另一常用的标签为GST-tag,一个26kDa的蛋白,其特点是表达量高,具高度抗原性,常用来增加目标蛋白的溶解度,但常常会影响目标蛋白的特性,一般推荐纯化后将标签去除[8]

而Strep-tag®(包含Strep-tag®II或是Twin-Strep-tag®),都是短肽标签,分别为8或28个氨基酸,一般不干扰蛋白折叠或活性,因此适合用于蛋白功能性研究[5]。Strep-tag®可以特异性地结合在Strep-Tactin®(二代介质)或Strep-Tactin®XT(三代介质)的生物素的结合位点。洗脱时使用的脱硫生物素(适用于二代)或生物素(三代),对同样的结合位点有更高的亲和力,能将目标蛋白从同样位置移除,因此得到的目标蛋白纯度一般高于95%[12]

同时,三代的 Strep-Tactin®XT与Strep-tag®蛋白的亲和力大幅提升,直接加入含目标蛋白的哺乳细胞的培养上清,即可高效纯化出所需蛋白(注:原本使用二代需先以Avidin或是BioLock将培养基中的生物素遮蔽,才不会影响纯化表现)。

2.三代Strep-Tactin®XT亲和力显著

图A比较了His-tag与Strep-tag®直接加入哺乳细胞培养上清纯化目标蛋白的表现。


图A

图A:分别向Strep-Tactin®XT High Capacity 1ml重力柱(左)和Ni-NTA 1ml重力柱(右)中,同时加入含4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST)或mCherry-His-tag (His)萤光蛋白的ExpiCHO细胞培养上清(注:接下来的实验皆是取哺乳细胞表达某抗体后的上清,另加入高纯度目标蛋白进行实验)。由图可见,Strep-Tactin®XT(左)能高效率的捕捉mCherry-TST,而右方的mCherry-His几乎无法挂柱。

此外,我们也测试了其他的蛋白,例如SEAP(72 kDa)或抗体(mAb,其重链为55kDa)。图B为以Strep-Tactin®XT纯化SEAP-TST、mCherry-TST与mAb-TST的SDS-PAGE分析结果,可见对于不同蛋白,Strep-tag®系统都能纯化出高纯度的目标蛋白。(注:红色标记处为 mCherry的降解产物,非杂带)


图B

因Strep-Tactin®XT与Twin-Strep-tag蛋白的高亲和力,即使目标蛋白的浓度低,使用Strep-Tactin®XT仍可以有效的捕捉上清中的目标蛋白。表C整理了几个实验的数据,显示当目标蛋白浓度低于20μg/ml时,得率仍能达到几近100%。


表C

3.Strep-Tactin®XT普适性高

除了上述实验所用的CHO细胞株外(中国仓鼠卵巢细胞),另一常用于生产蛋白的哺乳动物细胞株为HEK293(人胚胎肾细胞),使用上较CHO简单。我们测试了Strep-Tactin®XT的纯化表现:表D1为以Expi293表达SEAP-TST或mAb-TST蛋白后,目标蛋白的浓度。图D2为纯化表现的SDS-PAGE分析。从中可知,与ExpiCHO培养基相同,直接将表达好的Expi293上清加入1ml Strep-Tactin®XT高载量重力柱中进行纯化,一样能够快速的得到高纯度的目标蛋白。


表D1


图D2

综上所述,Strep-tag®非常适合用在哺乳动物细胞系中表达目标蛋白,其纯化过程也与常见的ExpiCHO及Expi293培养基相容,不须另外处理,让实验流程更为便利。加上Strep-tag®系统在纯度上的优势,是目前在这个应用上的绝佳选择。

4. IBA哺乳动物细胞表达/纯化蛋白相关产品

产品信息

表E1 含Twin-Strep-tag®的哺乳动物细胞表达载体

名称

货号

Twin-Strep-tag®

分泌信号

规格

网站报价

N端

C端

pCSG-IBA105

5-5105-001



5ug

¥3,174

pESG-IBA105

5-4505-001



5ug

¥3,174

pCSG-IBA103

5-5103-001



5ug

¥3,174

pESG-IBA103

5-4503-001



5ug

¥3,174

pCSG-IBA104

5-5104-001


5ug

¥3,174

pESG-IBA104

5-4504-001


5ug

¥3,174

pCSG-IBA102

5-5102-001


5ug

¥3,174

pESG-IBA102

5-4502-001


5ug

¥3,174

表E2 pCSG与pESG的区别

载体系列/内建基因

pCSG

pESG

CMV Promoter

oriP


EBNA-1


SV40 origin

NeoR

CoIE1 + Amp

BM40

表E3 IBA三代产品信息

名称

货号

规格

网站报价

Strep-Tactin®XT Superflow® 50%

suspension

2-4010-002

4 ml

¥1,365

2-4010-010

20 ml

¥4,814

2-4010-025

50 ml

¥11,437

Strep-Tactin®XT Superflow® gravity flow

columns

2-4011-005

5×0.2 ml

¥2,361

2-4012-001

1 ml

¥1,012

2-4013-001

5 ml

¥3,051

2-4014-001

10 ml

¥5,734

Strep-Tactin®XT Superflow® cartridges

(for Äkta/peristaltic pumps)

2-4021-001

1 ml

¥1,181

2-4022-001

5 ml

¥3,051

Strep-Tactin®XT Superflow® high

capacity 50% suspension

2-4030-002

4 ml

¥1,824

2-4030-010

20 ml

¥6,562

2-4030-025

50 ml

¥15,178

Strep-Tactin®XT Superflow® high

capacity gravity flow columns

2-4031-005

5×0.2 ml

¥3,051

2-4032-001

1 ml

¥1,365

2-4033-001

5 ml

¥4,186

2-4034-001

10 ml

¥7,880

Strep-Tactin®XT Superflow® high capacity cartridges (for Äkta/peristaltic pumps)

2-4025-001

1 ml

¥1,518

2-4026-001

5 ml

¥4,431

MagStrep "type3"XT beads 5% suspension

2-4090-002

2 ml

¥2,724

Strep-Tactin®XT Spin Column Kit

2-4151-000

1 kit

¥2,300

Strep-Tactin®XT immobilization plate

2-4101-001

1 plate

¥796

Twin-Strep-tag® Capture Kit

2-4370-000

1 kit

请咨询

参考文献

[1] Sahdev S, Khattar SK, Saini KS (2008). Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem., 307(1-2):249-64

[2] Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, Mccafferty J (2004). Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC Biotechnol., 4:32. doi: 10.1186/1472-6750-4-32

[3] Khan KH (2013). Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications. Adv Pharm Bull., 3(2): 257-63. doi: 10.5681/apb.2013.042

[4] Wegner GJ, Lee HJ, Corn RM (2002). Characterization and optimization of peptide arrays for the study of epitope-antibody interactions using surface plasmon resonance imaging. Anal Chem., 74(20):5161-8.

[5] Terpe K (2003). Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl.Microbiol.Biotechnol.,60(5): 523-33. doi: 10.1007/s00253-002-1158-6

[6] Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S (2005). Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif., 41(1):98-105.

[7] Tessema M, Simons PC, Cimino DF, Sanchez L, Waller A, Posner RG, Wandinger-Ness A, Prossnitz ER, Sklar LA (2006). Glutathione-S-transferase-green fluorescent protein fusion protein reveals slow dissociation from high site density beads and measures free GSH. Cytometry A., 69(5):326-34.

[8] Kimple ME, Brill AL, Pasker RL (2013). Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci., 73: Unit 9.9. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73.

[9] GE Healthcare (2016). Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged Proteins.

[10] Thermo Fisher Scientific (2015). Protein Expression Handbook

[11] Dynamic Biosensors (2018) Application Note: High-affinity capturing of tagged proteins on the switchSENSE® biochip using Strep-Tactin®XT.

[12] IBA Lifesciences (2016) Application Note: Strep-Tactin®XT:Twin-Strep-tag®- Advantages compared to the His-tag purification system.

[13] Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol., 326:245-54.

IBA lifesciences(德国):IBA公司总部位于德国。二十年来,IBA以杰出的专利技术Strep-tag®系统为基础,发展出完整的产品组合,涵盖重组蛋白表达纯化与固定以及特定细胞从全血或相关体液中分离的技术。同时,IBA也是全球领先的核酸合成专家,在DNA及RNA寡核苷酸的合成上已有超过二十年的经验,能根据客户的选择,生产含有特定染料或化学修饰的特殊寡核苷酸。


微博名称:达科为生物城
微博地址:
http://e.weibo.com/bjdakewe

微信二维码:
北京达科为生物技术有限公司  京ICP备13014125号-1
全国免费热线:400 819 7199 Email:bj_info@dakewe.net
联系我们
© Copyright 2013 Hewlett-Packard Development Company, L.P. All Rights