[文献分享]流式多色分析——子宫内白细胞的分离与鉴定

在怀孕期间，母胎界面（maternal-fetal interface）是一个活跃的免疫部位。胎儿和母体组织之间的这种亲密接触为胎儿提供了充足暴露于母体免疫系统的抗原。母体免疫细胞在维持子宫内平衡中发挥重要作用，在着床和胎盘早期促进促炎状态，在妊娠中期和晚期促进抗炎环境，最终在分娩期间促炎环境形成。母体免疫细胞和胎儿滋养层细胞是母胎界面炎症和免疫调节反应的重要调节因子，有益于子宫内的免疫环境。

Kahn等人采用了一种从胎盘床收集白细胞的技术，即在剖腹产后使用手术海绵擦拭子宫腔。这种方法通常用于确保胎盘从子宫腔中完全移除并清除多余血液，因此不会给患者带来额外的风险。本文采用这种方法分析胎盘床NK细胞、T细胞、B细胞和单核细胞的表型，并与外周血样本中对应细胞进行比较。

流式分析使用的抗体，如下表所示（BD LSRII flow cytometer）：

图1  在人类足月剖腹产分娩时，PBMC和UBMC（uterine blood mononuclear cells，子宫血单个核细胞）样本的白细胞分析。

（A）从PBMC和UBMC样本中识别主要白细胞亚群的圈门策略。

（B）活细胞和活CD45⁺细胞：

（i）单核细胞：CD45⁺CD14⁺；

（ii）CD4 T细胞：CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD8^-；

CD8 T细胞：CD45⁺CD3⁺CD4^-CD8⁺； 

（iii）CD127^high T细胞 ：CD45⁺CD4⁺CD25⁺⁺CD127^highFoxP3^- 和

T regulatory细胞：CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD8^-CD25⁺FoxP3⁺CD127^low

（iv）NK细胞亚群：CD3^-CD16⁺CD56⁺和CD3^-CD16^-CD56⁺⁺ 

（v）B细胞：CD3^-CD19⁺和活化的B细胞：CD3^-CD19⁺CD86⁺HLA-DR⁺。

子宫NK细胞具有CD45⁺CD3^-CD16^-CD56⁺⁺的特征性表型，外周血样本中也具有少量相同表型的细胞。同样，传统NK细胞的表型为CD3^-CD16⁺CD56⁺⁺，这些细胞占外周NK细胞的大部分。而胎盘床细胞中CD16^-CD56⁺⁺ NK细胞比外周血样本更丰富（CD45⁺CD3^-百分比分别为18.41 ± 3.44% vs. 2.73 ± 0.29%，N = 10）（见下图2）。

图2 在足月剖腹产分娩时，CD16^-CD56⁺⁺和CD16⁺CD56⁺⁺ NK细胞亚群的检测。

为了比较CD16^-CD56⁺⁺和CD16⁺CD56⁺⁺细胞在胎盘床和外周血中的活化状态，本文检测了细胞表面脱颗粒标志物CD107a的表达。胎盘床血中活化CD16^-CD56⁺⁺细胞的百分比与外周血相当（分别为35.87 ± 5.84%和47.84 ± 5.91%）（图3A）。同样，胎盘床血中活化CD16⁺CD56⁺细胞的百分比与外周血相似（分别为52.86 ± 4.74%和52.76 ± 5.29%）（图3B）。

图3 在足月剖腹产分娩时，活化（CD107a⁺） CD16^-CD56⁺⁺和活化CD16⁺CD56⁺⁺细胞亚群的检测。

与外周血白细胞相比，胎盘床样品中的CD16^-CD56⁺⁺NK细胞明显表达更高的CCL5 mRNA（图4）。另一方面，胎盘床和外周血中CD16⁺CD56⁺⁺细胞表达的RANTES mRNA水平相似。此外，在胎盘床和外周血样本中，两种NK细胞中IL8和PGF mRNA水平均无差异。

图4 PrimeFlow RNA检测：CCL5、IL8和PGF。

   外周血单核细胞（CD45⁺CD14⁺）占比为12.47% ~ 44.69% （N=10），平均百分比为27.42 ± 3.31%。胎盘床样本中CD45⁺CD14⁺单核细胞的平均百分比（占活CD45⁺细胞的6.38 ± 1.45%）低于PBMC（27.42 ± 3.31，图5A）。此外，与外周血单核细胞相比，胎盘床单核细胞活化标志物CD86和HLA-DR的表达比例较低（在CD14⁺细胞占比分别为50.24 ± 7.53%和90.63 ± 2.60%）（图5B）。

图5 总的白细胞（活CD45⁺细胞）中CD14⁺单核细胞的百分比。

外周血B细胞（CD45⁺CD3^-CD19⁺）占总活的CD45⁺白细胞比例高于胎盘床样品（分别为10.34 ± 0.94%和5.36 ± 1.33%）（图6A）。为了研究B细胞的活化状态，本文还检测了CD86和人类白细胞抗原（HLA）II类分子HLA-DR的表达。外周血和胎盘床样品中表达这两种受体的B细胞比例相似（图6B）。

图6 与外周血白细胞相比，足月子宫白细胞含有的B细胞比例较低。

   胎盘床和外周血中活的CD45⁺白细胞中CD4⁺ T淋巴细胞的平均百分比相似（图7A）。然而，与外周血样本相比，胎盘床中CD8⁺ T细胞的占比更高（图7B）。

图7 PBMC和UBMC白细胞群中T细胞群的检测。

本文展示了一种使用外科纱布成功分离活的蜕膜细胞的方法，并通过流式细胞术分析免疫细胞的特性。根据该方法获得的子宫白细胞存活率>95%，除流式细胞术分析外，还可以用于细胞分选和功能分析。借助免疫细胞亚型特异性标记物，以流式细胞术的方法进行分离，可以提高靶细胞群的纯度。结果表明，这种方法可用于子宫白细胞的研究，包括妊娠并发症等情况。

参考文献：Parasar P, Bernard M, Ahn SH, et al. Isolation and characterization of uterine leukocytes collected using a uterine swab technique. Am J Reprod Immunol. 2022;88（5）:e13614. doi:10.1111/aji.13614.