【文献分享】一种可“DIY”的四聚体——Flex-TTM在肿瘤新抗原研究中的应用

前言

T细胞介导的免疫应答是由抗原递呈细胞和T细胞之间通过主要组织相容性复合物（MHC）和T细胞受体（TCR）的相互作用决定的，因此鉴定和分析抗原特异性T细胞在疫苗疗效监控，癌症研究、病毒感染、抗原分析等研究种至关重要。四聚体技术可在单细胞水平上标记抗原特异性T细胞并通过流式细胞术检测。四聚体通常由4个MHC单体分子和1个链霉亲和素组成，是一种快速、方便的抗原特异性T细胞检测技术。 

下面我们跟大家分享一篇运用Flex-T^TM “DIY”的四聚体（Flexible-Tetramers）进行肿瘤治疗相关研究的文献，作者使用Flex-T^TM UV-labile Momomer UVX（Biolegend，Cat#280004）制备针对Neo-T特异性抗原的四聚体进行抗原特异性T细胞检测分析。

研究背景

过继性T细胞疗法（ACT）正成为癌症患者强有力的治疗选择，包括嵌合抗原受体（CAR） T细胞、T细胞受体（TCR）T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的过继转移。其中，有研究证实了TILs的过继转移可以介导几种实体瘤的持久消退，然而，然而，收集TILs需要对肿瘤组织进行侵入性采样，并且往往受到切除肿瘤组织相对较小的限制，并且一些肿瘤部位也不容易接近。最近，一些研究报道在癌症患者的外周血中发现了识别新抗原的T细胞克隆。外周血淋巴细胞（PBLs）中的T细胞能识别与TILs相同的P53新抗原。因此，PBL可能是开发新抗原靶向ACT治疗癌症患者的可靠且无创的T细胞来源。

通常在ACT之前需要进行非清髓性淋巴细胞耗竭（氟达拉滨和环磷酰胺是淋巴细胞耗竭化疗中最常用的药物），目的是抑制宿主免疫系统，以降低免疫原性，增加IL-2、IL-7、IL-15等的可用性，减少调节性T细胞，增加输注T细胞的持久性。然而，淋巴细胞减少也会导致神经毒性、中性粒细胞减少症、贫血和更大的感染风险。淋巴细胞耗竭的剂量强度在不同的中心和临床试验中差异很大，并且似乎是T细胞产物特异性的。那么，四聚体检测技术在本研究中扮演着何种角色呢？

研究内容

针对这些问题，中山大学徐瑞华团队在2023年6月10日发表了题为“A pilot study of lymphodepletion intensity for peripheral blood mononuclear cell-derived neoantigen-specific CD8⁺ T cell therapy in patients with advanced solid tumors”的研究论文。该研究开发了一种从癌症患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中产生个性化Neo-T（新抗原特异性CD8⁺ T细胞）的方法。作者建立了一个流程，包括通过生物信息学分析预测新抗原，并在25天内大规模扩增新抗原特异性T细胞。为了评估Neo-T治疗的临床疗效并确定Neo-T治疗的最佳淋巴细胞耗竭强度，作者进行了一项首次在人体中使用氟达拉滨和环磷酰胺增加剂量的Neo-T治疗的研究。该研究是一项开放标签I期临床试验（NCT02959905），包括标准治疗难治的局部晚期或转移性实体瘤患者。

图. 新抗原预测和Neo-T制造流程示意图

图. Neo-T疗法临床试验图

A：临床试验流程图；B：临床试验方案

此外，为了确认每个患者产生的Neo-T能够识别预测的新抗原，作者通过四聚体检测技术检测了Neo-T中的CD8⁺ T细胞以及新抗原特异性细胞。根据四聚体染色结果，所有Neo-T产物的细胞存活率和CD8⁺ T细胞百分比均大于90%，Neo-T中新抗原特异性T细胞在0.5%至45%之间。四聚体检测大致流程如下：

四聚体检测Neo-T细胞实验流程

1、收集细胞，洗涤，在FACS缓冲液中重悬；

2、通过紫外线辐射介导的肽交换法生成肽- MHC单体，再与荧光标记的链霉亲和素合成四聚体；

3、使用小鼠抗人CD3、CD8和Flex-T™ 四聚体，在4°C下染色15分钟；

4、在FACS缓冲液中洗涤两次；

5、使用流式细胞仪对细胞进行分析，基于DAPI对活细胞圈门，并对“CD8⁺ pMHC -四聚体⁺细胞”进行分类；

6、使用流式数据处理软件对数据进行分析。

（Flex-T^TM四聚体制备和流式染色详细Protocol可前往Biolegend官网查询：https://www.biolegend.com/en-us/protocols/flex-t-tetramer-preparation-and-flow-cytometry-staining-protocol）

图：Neo-Ts细胞流式分析圈门策略

研究结果

研究结果表明，在Neo-T治疗期间，从无淋巴细胞耗竭到高剂量治疗，不同的淋巴细胞耗竭剂量耐受性良好。Neo-T疗法在晚期实体瘤患者中显示出良好的临床疗效，ORR（客观缓解率）为33.3%（3/9），DCR（疾病控制率）为66.7%（6/9）。与高强度组相比，无淋巴细胞耗竭组在Neo-T治疗期间出现PR（部分缓解）的患者更多。在两名有反应的患者中检查新抗原特异性TCR，并在淋巴细胞耗竭治疗后显示延迟扩张。

综上，该研究揭示，没有淋巴细胞耗竭的Neo-T疗法可能是晚期实体瘤的安全且有前途的治疗策略。

Flex-T^TM UV-labile Momomer——抗原特异性T细胞分析的理想工具

Flex-T^TM UV-labile Momomer，一款Biolegend推出的抗原特异性T细胞检测工具，是一种预载了UV敏感多肽的生物素化MHC单体。在经过UV照射后，Flex-T^TM UV-labile Momomer的多肽结合位点暴露，感兴趣的目标肽加载，产生具有足够亲和力的“DIY” MHC Monomer，肽交换效率可使用ELISA进行检测，“DIY” MHC Monomer与Streptavidin 组装成不同的Tetramer。这种灵活的处理方式实现了感兴趣多肽或者抗原特异性T细胞的高通量筛选。如今，这一款抗原特异性T细胞分析工具已被运用在多个研究方向中，例如肿瘤、感染性疾病（COVID-19、HBV等）、疫苗研发等。

本研究中使用的Flex-T™产品

参考文献：

Li, D., Chen, C., Li, J., Yue, J., Ding, Y., Wang, H., Liang, Z., Zhang, L., Qiu, S., Liu, G., Gao, Y., Huang, Y., Li, D., Zhang, R., Liu, W., Wen, X., Li, B., Zhang, X., Zhang, X., & Xu, R. H. (2023). A pilot study of lymphodepletion intensity for peripheral blood mononuclear cell-derived neoantigen-specific CD8 + T cell therapy in patients with advanced solid tumors. Nature communications, 14(1), 3447. https://doi.org/10.1038/s41467-023-39225-7

Supplementary Information：

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/instance/10257664/bin/41467_2023_39225_MOESM1_ESM.pdf