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ELISA实验操作注意事项及常见问题解答

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20150105 打印 字体:  
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一、ELISA操作前准备工作


试剂盒的选择


ELISA操作前,应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。


样本处理


在收集标本前需有一个完整的计划,需要清楚要检测的成份是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测,对收集后当天就进行检测的标本,及时储存在4℃备用,如有特殊原因需要周期收集标本,请取材后,将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差,蛋白极易降解,直接影响实验质量,所以避免反复冻融。

 

二、ELISA标准品溶解

 

标准品是试剂盒的检测抗原的一个度量标尺,因此标准品的溶解、倍比稀释和保存要特别注意以下细节:冻干标准品溶解按照说明书的要求,准确复溶。在冰上操作标准品为佳,静止5-10分钟,轻轻摇匀后按照一次量分装,在-20度或-70度保存。标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备,如离心管的准备和编号以及稀释液的准备;稀释时,应充分混匀;采用进口或者硅化的EP管,减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时,注意操作规范,枪头勿刮划预包被的孔底。

 

三、ELISA操作中的洗涤

 

洗涤是ELISA实验中是最多次数的操作,也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象,实验重复效果差的现象。不管用多道加样器、洗瓶、吸管,还是洗板机,严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象,请比照“手工洗板小贴士”操作:

 

a)洗液不要溢出孔外,以免污染相邻的孔,特别是每次洗板的前两遍,若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定会增高。

 

b)特别注意:设计实验的时候要考虑实验孔的位置,保证甩掉洗液时,空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开最好。同时注意甩掉洗液的动作翻转(从正上方旋转120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体!甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。 

 

c)用干净的滤纸,不要用卫生纸,因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底,导致洗板不干净,结果偏高或偏低,重复孔的数值也会相差很大。

 

d)每次拍板不要重复在一个地方拍,特别是洗去酶的步骤;拍板不宜过轻,否则拍不干净,拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重,以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下,最后一次一定要扣干净。

 

e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短,洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。

 

四、ELISA的标准曲线如何拟合?

 

一般情况按照说明书推荐方法拟合标准曲线。标准曲线可以由酶标仪附带软件自动生成,也可手动制作。标准曲线呈“S”形曲线,两端趋于水平,中间趋于线性,中间部分为较佳的检测范围。当标准品的量超过与包被抗体结合的量,此时标准品已饱和,再增加标准品的量,其OD值不再变化,故当标准品达到一定浓度后,曲线就趋于水平。一般厂商给出的浓度范围落在中间线性范围,根据标准曲线,可以测出样本的浓度。按照科学分析方法,如果存在“奇异点”或者“污点”,直接采用线性分析不是很好,要对拟合标准曲线的几个点进行取舍,同时也可改用双对数直线拟合或者四因素曲线拟合。

 

五、常见问题

 

1、ELISA试验出现非常弱的结果,常见有7种原因,其解决方法如下:


1)可能原因:温育的时间或者温度不够;

解决方法:校正温育箱温度。

 

2)可能原因:显色反应时间太短;

解决方法:校正定时钟准确定时。

 

3)可能原因:所用配制缓冲液的蒸馏水有问题;

解决方法:使用新鲜合格的蒸馏水。

 

4)可能原因:加入抗体/酶的稀释液浓度太低;

解决方法:按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液。校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密。

 

5)可能原因:酶标仪滤光片不正确;

解决方法:检查酶标仪使用的滤光片。

 

6)可能原因:试剂盒没有充分平衡;

解决方法:试剂室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温。

 

7)可能原因:不正确的试剂储存方式;

解决方法:按照说明书要求保存试剂盒。

 

2、试验的标准曲线和测定的重复性差,这是什么原因造成的?

答:试验的标准曲线和测定的重复性差,这是典型的由测定操作引起的问题,常见原因如下:

 

a)可能原因:加样本及试剂量不准;孔间不一致;

解决方法:校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密。

重复某一样品时,加样时间尽可能与第一次接近;

重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;

样品稀释前应充分混匀。

 

b)可能原因:加样过快,孔间发生污染;

解决方法:重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;加样不要过快。         

 

c)可能原因:加错样本;

解决方法:检查记录和试剂,是否加错样本。

 

d)可能原因:加样本及试剂时,加在孔壁上部非包被区;

解决方法:加样枪头不要贴壁。

 

e)可能原因:不同批号试剂盒中组分混用;

解决方法:不同批号试剂盒中组分不可混用。

 

f)可能原因:温育时间、洗板、显色时间不一致;

解决方法:检查时间是否一致。

 

g)可能原因:孔内污染杂物;

解决方法:离心样品,排除杂物。

 

h)可能原因:试剂/样品没有混匀;

解决方法:充分混匀样品和试剂。

 

i)可能原因:血清标本未完全凝固即加入,反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血    

细胞,易出现假阳性反应等。

解决方法:待血清标本完全凝固后做试验。

 

3、 试验结果白板,而且阳性对照不显色,应如何分析和查找原因?

答:试验结果白板,而且阳性对照不显色,常见原因如下:

 

a)可能原因:漏加或者误加试剂;

解决方法:检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。

 

b)可能原因:试剂过期;

解决方法:使用有效期内的产品。

 

c)可能原因:洗板液配制中出现问题,如量筒不干净含HRP酶抑制物(叠氮钠 

等);

解决方法:使用干净的器皿,正确配制试剂。

 

d)可能原因:温育的时间或温度不够;

解决方法:校正温育箱温度。

 

e)可能原因:标准品失活或者丢失;

解决方法:标准品正确保存、溶解和混匀。

 

f)可能原因:抗体失活或者丢失;

解决方法:更换抗体或者提高抗体浓度

 

g)可能原因:酶失活或者丢失

检查方法:把工作浓度的酶再稀释20-100倍,取5uL加入50ul的显色底物,终止后显色是否能达到1.0左右,此为酶的粗略估计。

解决方法:更换酶或者提高酶的浓度。  

 

h)可能原因:显色底物失活

检查方法:加少量的工作浓度的酶,TMB是否很快显色。

解决办法:更换显色底物.

 

4. 试验结果空白背景高,这是什么原因造成的?

答:试验结果空白背景高,常见原因如下:

 

a)可能原因:洗板不干净;

解决方法:充分洗涤,彻底拍干;洗板要防止交叉污染;浓缩洗液准确配制;吸嘴尽可能一次性使用;加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用,不要反复使用,否则易造成污染。

 

b)可能原因:显色液变质或者试剂过期;

解决方法:检查试剂盒有效期。

 

c)可能原因:试剂稀释有误,如加酶的浓度过高;

解决方法:请按说明书所示稀释倍数配制;

 

d)可能原因:蒸馏水受酶等污染;

解决方法:使用新鲜蒸馏水;

 

e)可能原因:试剂混用;

解决方法:不同批号试剂勿混用。

 

f)可能原因:培养箱温度超过37℃或反应时间过长。

解决方法:显色反应时间适当缩短。

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