ELISA常见FAQ（三）--那些容易被忽略的注意事项

• ELISA试剂盒为什么要平衡至室温？ 

ELISA试剂盒的温度平衡对ELISA实验很重要，需要实验者引以为重。试剂盒使用前平衡至室温的意义在于ELISA实验对温度敏感。

a.平衡浓缩洗液是为了溶解在2~8℃保存时出现的结晶。只有平衡至室温并确保结晶完全溶解，才能准确配制洗液的浓度。

b.平衡稀释液是ELISA实验在室温或37度孵育的前提条件。若没有平衡至室温，如某些步骤只孵育1小时，甚至20min，那么ELISA实验反应效率就由于反应温度过低而大大降低，导致实验OD值读数非常低。

c.预包被板的平衡有利于开包装后剩余预包被板条的保存，预包被板条保存在真空干燥的铝箔袋中，平衡至室温后打开铝箔袋，就可以避免外界的水汽凝结在板条上。同时，拆开包装的板条要减少在外界暴露的时间，保留干燥剂在袋中，用胶带或带封口的塑料袋密闭封口2~8℃保存，在1个月内使用。

• ELISA的标准品如何操作？ 

标准品是试剂盒的检测抗原的一个度量标尺，因此标准品的溶解、倍比稀释和保存要特别注意以下细节：冻干标准品溶解按照说明书的要求, 准确复溶。在冰上操作标准品为佳, 静置5-10min，轻轻摇匀后按照一次量分装，在-20℃或-70℃保存。标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备，如离心管的准备和编号以及稀释液的准备；稀释时，应充分混匀；采用进口或者硅化的EP管，减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。

• ELISA的标准曲线如何拟合？ 

针对不同情况应当如何选择合适的标准曲线呢？

尝试使用不同标度绘制曲线，例如对数-对数、5-参数逻辑曲线拟合。

--线性图：一个坐标轴表示抗原的浓度，另一个表示读数。R2值在此通常用于确定拟合，数值大于0.99表示拟合非常好。然而，线性图往往会压缩曲线下端上的数据点，导致计算结果不准。

--半对数图：帮助抵消线性图引起的下端压缩。半对数图使用浓度的对数与读数的关系。这种方法通常会得到数据点分布更均匀的S形曲线。

--对数/对数图：为低到中浓度范围提供良好的线性。但范围的高浓度端则容易失去线性。

--4或5参数逻辑（4PL或5PL）曲线：方法更复杂，考虑了其他参数比如说最 大值和最 小值，因此需要更为复杂的计算。4PL假设拐点周围对称，而5PL考虑了不对称的情况，通常更适合免疫分析。如果您的软件允许，则4PL和5PL将适用于大部分ELISA校正标准曲线。如果您的软件不允许，则建议选择是使用半对数或对数/对数图。

• ELISA操作中的洗涤要注意哪些？

洗涤是ELISA实验中最多次数的操作，也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象，导致实验重复效果差。不管用多道加样器、洗瓶、吸管，还是洗板机，均需严格按照说明书操作，不得减少洗涤步骤、洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差。操作者常出现洗板不干净现象，请比照“手工洗板小贴士”操作：

a.设计实验的时候要考虑实验孔的位置，保证甩掉洗液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧，还要注意甩掉洗液的动作要迅速、干脆。

b.洗液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定会增高。

c.用干净的滤纸，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大。

d.每次拍板不要重复在一个地方拍，特别是洗去酶的步骤；拍板不宜过轻，否则拍不干净，但注意不要太重，以致把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下，最后一次一定要叩干净。

e.洗板时间（静置1分钟）和次数一定要符合要求，洗板时间太短，洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。

• ELISA实验中如何判定终止反应的时间？

判定ELISA终止反应时间建议根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来终止反应，通常显色10-20分钟就可以达到很好的效果或直接在610~630nm测定标准曲线最 高浓度对应的吸光值，在0.7~1.0之间即可选择终止反应。