ELISPOT实验常见问题

1． 提取外周血淋巴细胞时，有那些注意事项？ 
答：如果取外周血淋巴细胞 (PBMC) 进行ELISPOT检测，更好采用新鲜血液。在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。抗凝血更好及时提取PBMC，避免放置时间过长，室温下避免过夜。应选用分离效果好的淋巴细胞分离液，避免PBMC中混有过多其他细胞成分或杂质。

2． 在分离外周血淋巴细胞时，发生了溶血，会影响我的试验结果吗？ 
答：外周血出现溶血后，在使用淋巴细胞分离液分离PBMC时，溶血产生的细胞碎片、血红素等杂质将极大可能悬浮于分离液的层面，在吸取PBMC时非常容易混入这些杂质，由于混入细胞的细胞碎片和血红素很难清洗去除，在进行ELISPOT实验时，有可能沉积在培养板底，严重影响细胞因子和抗体的结合，进而影响实验结果。

3． 采用什么方法分离外周血淋巴细胞适合于ELISPOT试验？ 
答：使用专业的淋巴细胞分离液。国产的如：达科为公司生产的EZ-SepTM Human 9×（分离人PBMC）、EZ-SepTM Monkey 9×（分离猴的PBMC）、EZ-SepTM Mouse 1×（也可用来分离大鼠/兔子等的外周血淋巴细胞）；进口的如：Optiprep、Lymphoprep等。

4． 从动物脾脏组织分离淋巴细胞应如何操作？ 
答：取动物脾脏组织时，应注意取材的无菌操作。分离出脾脏组织，研磨后过200目筛网，保证所分离的细胞为单个细胞悬液。获得细胞悬液后应该使用相应的淋巴细胞分离液进一步分离单个核细胞。

5． 在ELISPOT板上，每孔应该放置多少数目的淋巴细胞？ 
答：在使用ConA，PHA等阳性刺激孔中，一般放置的淋巴细胞数为 104～2×105。在使用抗原作为刺激剂的情况下，每孔细胞浓度可在1～4×105。在使用多克隆刺激剂的情况下，应适当调低细胞浓度。但由于所用刺激剂的强度和批号不同，建议初次进行ELISPOT检测时，对刺激剂浓度和细胞浓度设立梯度，以保证较理想的实验结果。

6． 对淋巴细胞进行：体外刺激预孵育、或板内同步刺激培养应如何操作？ 
答： 将抗原和淋巴细胞在体外混合，刺激并预孵育，是通用的方法。预孵育的淋巴细胞，在置入ELISPOT板之前应使用复温到37℃的培养液清洗细胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培养5～6小时。 对于高度特异性抗原，可以采用将淋巴细胞和抗原同时加入ELISPOT板孔中，37℃培养箱中，同步进行刺激、培养、和细胞因子捕获。淋巴细胞板内同步刺激培养的时间通常为22～24小时。

7． 在ELISPOT实验中刺激物应如何选择？ 
答：常用的非特异性刺激物有PMA/inomycin、PHA、Con A。根据具体的实验选择上稍有稍有不同，一般而言：刺激小鼠细胞用Con A或者PMA/inomycin，刺激人 PBMC多用PHA。 特异性的刺激物主要有CEF、ICE（只能用于人）等多肽或者蛋白。具体的技术问题详情电话垂询。

8． 在使用抗原刺激淋巴细胞培养过程中，我发现培养液变黄，有什么影响？ 
答：这种现象通常见于使用很强的多克隆抗原刺激淋巴细胞，某些多克隆抗原会导致淋巴细胞凋亡或者死亡，大量淋巴细胞死亡后使培养液变黄。使用这些淋巴细胞进行后续ELISPOT试验通常得到很低的斑点（SPOT）形成。换用特异性抗原后可以避免该现象。

9． 在ELISPOT结果中出现：不规则的大块斑点，有的区域没有斑点是什么原因？ 
答：不规则斑点区域的出现一般是细胞分离不完全所至，有时候采用多克隆抗原孵育的淋巴细胞也会产生成团现象。请确认加入到ELISPOT板中进行孵育的是单细胞悬液。

10.关于培养基的选择问题 
答：推荐使用无血清培养基（注意：是指专业的完全培养基，不是不含血清的1640等基本培养基）如国产的达科为公司的生产的Lympho-SpotTM 无血清培养基、进口的荷兰U-Cytech公司生产的Lympho-SpotTM serum free medium等。当然客户也可以根据实际情况选用自备的1640培养基（含5%血清），但是血清带来的干扰无法排除。