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关于细胞冻存复苏的理论知识

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130829 打印 字体:  
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可能很多读者对细胞的冻存复苏的实验操作与步骤心存疑虑,在这里给大家介绍一些关于细胞冻存复苏方面的理论知识。

 

基本概念:存活率与恢复率

细胞冻存复苏的质量可以通过存活率viability)来衡量。即在细胞复苏、洗涤后,用台盼蓝进行细胞计数。存活率 = 活细胞数 / 细胞总数×100%。经台盼蓝染色,活细胞呈无色,晶莹透亮;死细胞呈蓝色,暗淡无光,直径比活细胞大1-2倍。

一般来说,如果细胞的存活率低于70%ELISPOT检测结果会很糟糕。补救办法是让细胞休息过夜,或者采用预孵育ELISPOT方法(见4.6节),检测结果会有改善。如果细胞存活率高于80%会获得较满意的ELISPOT结果。如果严格按本实验规范,可以保证存活率达90%。在此存活率下,复苏细胞可以直接做ELISPOT检测,不需休息过夜。

与存活率相关联但又有显著区别的另一个概念是恢复率(recovery。恢复率是指冻存、复苏之后回收到的活细胞和冻存前活细胞的比例。恢复率的高低取决于两个影响因素,即存活率和洗涤丢失比例。使用本试剂盒,细胞的存活率很高,它对恢复率的影响可以忽略。所以对恢复率的主要影响因素是洗涤过程中细胞的丢失。本操作手册中有两步洗涤,推荐的离心条件是400g离心10min,按照这种操作,细胞的丢失应该在可接受的范围之内。同时我们推荐较高的细胞冻存浓度,即1x107cells/ml,甚至可以更高。如果细胞达不到这种浓度,也至少应该达到5×106cells/ml

 

细胞为什么会被冻死?

使细胞死亡的原因并不是低温,相反,低温可以减缓甚至暂停细胞生命运动,使其长期保存。让细胞死亡的真正原因是水。不错,正是水分。水分在冷冻的过程中会结冰,从而给细胞带来双重伤害。

第一重伤害在于水结冰的过程。我们知道,冰是一种晶体。结冰的过程,就是水分子不断的填充到冰晶的阵列当中,使冰晶体不断长大的过程。看过水晶的人对晶体都会有一种直观认识,那就是晶体有非常分明的棱角,冰晶也是这样。不论是细胞内、还是细胞外的冰晶,在生长过程中能够不断的外延,很容易就会刺破细胞的各种生物膜,尤其是质膜,从而导致细胞死亡。这是细胞被冻死的首要原因。

第二重伤害机制很好理解,那就是水在结冰的过程中,体积会增加1/10。体积膨胀伴随的微观运动会使各种水合蛋白原子之间发生位移,化学键被扭曲,导致蛋白变性失活。各种蛋白制剂要避免反复冻融就是这个道理。体积膨胀伴随的宏观运动会使各种封闭的细胞器、细胞核乃至整个细胞也跟着膨胀,有可能在膨胀过程中发生生物膜破裂事件。由水的体积膨胀导致的伤害相对来说居于次要地位。

这两重伤害是如此的严重,以致于脆弱的哺乳动物细胞如果不添加保护剂,几乎都会在冻融的过程中死亡。那么,冻存保护剂又是什么东西呢?

 

冻存保护剂的原理是什么?

冻存保护剂分两类,保护原理各不相同。第一类称为细胞外保护剂,多是高分子物质,比如甲基纤维素,聚乙二醇(PEG),血清白蛋白等等;第二类称为细胞内保护剂,比如甘油、二甲基亚砜(DMSO)等等。

第一类保护剂的作用是分隔细胞外的溶液空间,阻止细胞外大冰晶的形成。因为细胞外保护剂都是高分子,一方面自身会结合大量自由的水分子,另一方面也会阻止未结合的自由水分子的运动,形成一个个相对阻隔的小空间。冰晶的形成与生长就被限定在这样一个个相互阻隔的小空间内,不能形成大的冰晶。也就是说,把原先少数大的冰晶分隔成了无数细微的小冰晶,极大地减少了对细胞膜的威胁。

第二类保护剂能进入细胞内,起到双重保护效果。第一重保护效果是保护细胞蛋白质,减轻冻融作用对蛋白质的损伤。因为内保护剂都是亲水的小分子,可以取代蛋白质表面的水合层,减轻水冻结膨胀造成的原子位移与化学键破坏。第二重保护是破坏细胞内冰晶的晶格结构,防止形成大的冰晶刺破细胞器与质膜。我们知道,晶体的生长是组成晶格的原子分子有序点阵堆积的结果。但是进入细胞内的这些亲水小分子可以取代水分子而堆积到冰晶的晶格中,造成晶体的结构缺陷。缺陷严重到一定程度,晶体就不再增长,对细胞结构的破坏也就降低了。另外还有证据表明,像DMSO可以起到水的结晶核作用,大量的结晶核相互竞争水分子,导致这些冰晶都长不大。

U-Cytech Cryostar™冻存试剂是各种冻存保护剂的优化与集大成者。重悬液中含有多种细胞外保护剂,2倍冻存液含同时含有细胞外冻存保护剂和细胞内冻存保护剂,可以保证冻存的最佳效果。

 

为什么要慢冻快融?

除了冻存保护剂之外,冷冻和升温的速度也直接影响细胞的存活率。做过细胞冻存复苏的人都可能听说过“慢冻快融”的原则。这条原则背后的科学道理是什么呢?

慢冻是为了减少细胞内的水分,从而降低水分结冰导致的伤害。为了说清这个道理,需要一点点物理学知识。我们知道,水溶液结冰是一个溶质溶剂相互作用的过程。溶液的浓度越高,开始结冰的温度(冰点)就越低。溶液结冰时,作为溶剂的水优先结冰,同时把溶质外排,这样就导致溶质的浓度越来越高。溶质的浓度越高,则剩下的溶液要进一步结冰,需要的温度就更低,直到一个最终完全结冰的温度(共熔点)。也就是说,水溶液的结冰是一个温度逐渐降低(从冰点最后降低到共熔点)、溶液浓度逐渐升高的过程。

但是这样的结冰过程也是有条件的,那就是外界的温度不能急剧降低,让溶剂结冰的时候,有足够的时间把溶质排除到冰体之外。否则,温度降低太快,溶质就会被困在溶剂中间一同凝固,这在物理学上叫玻璃化凝固,而非真正的结冰。慢冻就是为了让冻存液真正结冰,结冰的过程中,冻存液的浓度会逐渐提高,渗透压也逐渐提高,细胞内的水分就会逐渐渗透到细胞外,从而减弱细胞内水分结冰导致的伤害。

理论和实践表明,细胞冷冻的速度控制在每分钟降低1°C效果最好。Nalgene公司的程序降温盒“Mr. Frosty”放置在-70冰箱内能够提供接近于1/min的降温速度。此外还有专门的程序降温仪也能严格控制冻存细胞的降温速率。我们不推荐任何传统办法,传统办法的人为因素太大,效果不稳定。

那么快融又是什么道理呢?快融是为了防止融解过程中的局部区域发生反复冻融。

 

 DMSO的特殊性所带来的特殊实验操作

二甲基亚砜(DMSO)是一种有效的细胞内保护剂,Cryostar™ 2×冻存液含有DMSODMSO具有脂溶性,细胞毒性,密度比水大。正是由于这些特殊性质,所以在细胞冻存复苏中会有一些相应的特殊操作。

先说脂溶性。DMSO能自由穿越细胞的脂质双分子层。穿透的速度取决于细胞内外两侧的浓度差。如果穿透速度太快,膜结构与膜蛋白都会受到损伤。所以,要控制细胞内外的DMSO浓度差,不能变化太剧烈。一方面,滴加冻存液时,DMSO的浓度要缓慢增加;另一方面复苏洗涤时,DMSO的浓度要缓慢下降。这就是在冻存和复苏程序中多处出现“逐滴加入”“缓慢加入”的原因。

接着说毒性。没错,DMSO确实有细胞毒性!但是它在冻存中能有效保护细胞,所以冻存液都离不开DMSO,我们要做的只能是减少DMSO对细胞的毒性。我们都知道,温度越低,细胞的生命活动越弱,对有毒物质的耐受就越强。凡是涉及到DMSO的地方我们都会提到“冰上操作”,用低温来减弱DMSO的毒性,这就是原因所在。

最后说密度。DMSO的密度大于水。Cryostar™ 2×冻存液含有DMSO,所以它的密度大于普通培养基和血清。为了获得充分的混合效果,一方面,在冻存程序中,Cryostar™ 2×冻存液要滴加到Cryostar™重悬液液面之上,这样高密度的Cryostar™ 2X冻存液就能靠重力的作用和下面低密度的Cryostar™重悬液有效混合;另一方面,在复苏程序中,低密度的血清和RPMI-1640培养基要缓慢加入到高密度冻存液液体的下方,这样低密度的液体靠浮力作用就能和上方的细胞冻存液有效混合。

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