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ELISPOT检测的质量控制

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130829 打印 字体:  
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一、ELISPOT质量控制简介
      一般来说,ELISPOT检测只要做到标准化就可以满足要求。但是,有些实验对ELISPOT检测数据的可信度有更高要求,比如疫苗的临床研究和某些疾病治疗对免疫系统影响的评估等,需要ELISPOT检测的质量控制。
ELISPOT质量控制是控制ELISPOT检测的质量(结果的准确性、重复性、可信度等)。如:工厂做生产出产品,工厂的质控是控制产品的质量;实验室做检测出数据,实验室的质控是控制检测数据的质量即准确性。

      那么如何能控制ELISPOT检测的质量呢?如果有一种细胞和一种刺激物,并且ELISPOT斑点频率是已知的话,那么就有了一个ELISPOT的标准系统。每次其它样品检测时,只要带上这个系统,实验者就可以用标准系统来质控待测样品的ELISPOT检测。这也是所有其它检测质控的基本原理。

      现在的关键是找到这样一种细胞和一种刺激物,每次都能做出完全相同的ELISPOT结果。


二、标准细胞必须采用冻存细胞库

     首要问题是细胞。我们知道,细胞是有生命的,不像无生命的物质那样容易保存。那么能不能采用新鲜细胞呢,比如每次都从同一个志愿者身上采集?不能。因为志愿者的健康状态和免疫状态都是动态的,虽说采自同一个人,但是细胞免疫水平可能会有变化,ELISPOT结果无法完全重复。那么能不能采集细胞之后长期饲养呢?不能。且不说长期培养成本高且周期长,细胞本身的免疫水平和克隆数目都会随着培养和传代而发生变化。

      能满足ELISPOT检测长期不变化的只能是冻存细胞库。一次采集大量细胞冻存在-197°C的液氮环境中,细胞的斑点频率可以在数年之内恒定不变。PBMC分离和冻存复苏的方法参见本网站内容。


三、标准刺激物选用CEF或者ICE

     那么,刺激物选择什么呢?非特异性的刺激物很便宜,但是不能用于质控。三个原因阻碍了这一点。

    其一、非特异性的刺激物刺激效果不稳定。如图9.2所示,非特异性的刺激物(有丝分裂原Mitogen)的刺激曲线几乎没有平坦的部分。也就是说,刺激物的浓度有细微变化,马上就会体现在刺激斑点数目的变化上了,这样实验结果很难完全重现。相反,抗原的刺激曲线非常平坦,只要达到有效刺激浓度,斑点频率就不再变化。


     其二,非特异性刺激物的刺激原理与特异性的刺激物刺激原理不同。一般来说,质控系统和被质控的体系之间越相近越好:经过相同的处理,接受相同的影响因素,发生相同的物理、化学、生物过程。但是非特异性刺激物刺激是单细胞过程,与抗原经APC呈递而刺激T细胞是完全不同的过程。所以用非特异性刺激反应质控与特异性刺激反应质控,从原理上也说不同。

     其三,非特异性刺激物多数是蛋白质,比如PHA与ConA,效价不稳定,容易失活,不易保存。相对而言,作为抗原的蛋白和多肽,免疫原性和刺激效果要稳定得多。

      综上所述,在质控系统中,标准刺激物宜选用抗原。抗原中,以T细胞表位肽组成最简单,机理最清楚,结果最稳定,所以是首选。再则考虑到标准刺激物对健康人的T细胞也应该能刺激作用,所以国际上选定三种常见病毒CMV、EBV、Flu Viurs,把它们的32条T细胞表位肽集中起来,作为ELISPOT标准样性刺激物CEF。另有简化版的23条肽肽库ICE(货号CT370),更加实用。 


 四、实验室内部质控与实验室之间的质控以及国家质控体系

      以上介绍了ELISPOT质控系统的原理与组成。现在来介绍一下质控系统的应用范围。根据质控系统的应用范围,可以分为以下三个层次。

     最基本的层次是实验室内部质控系统。比如一个实验室有好几组实验人员,会在很长的时间内(一年或数年)做高质量的ELISPOT检测。这就需要用到实验室内部的质控系统。因为实验室内部的条件相对稳定,管理相对统一,实验室内部质控系统的技术目前已经非常成熟。达科为公司有整套建立实验室内部ELISPOT质控系统的方案,已经帮国内数家实验室建立了这一系统。实践也证明了该系统有效可行,指控效果非常明显。

     第二个层次是实验室之间的质控系统。当今的科研有合纵连横的趋势,一些重大的科研项目或者疫苗的临床评估往往是跨实验室、跨地域甚至跨国家的联合项目。为了使这些分布在不同地区不同时间的ELISPOT检测有相同的标准和可信度,必须采用实验室之间的质控系统。就我们达科为公司与国内十余家实验室联合作的评估而言,实验室之间的质控存在唯一的一个非技术障碍,那就是冻存质控细胞的运输问题。

     冻存细胞最好能通过液氮运输,如果采用小型背负式液氮罐,实验者可以在同一城市的不同实验室之间运输冻存细胞,但是对于跨城市或者跨国家的长途运输就不太可能了。液氮罐上飞机或者火车都是非法的。如果采用干冰运输,冻存细胞的状态和存活率就会打折扣。我们的研究表明,经过干冰运输的细胞,存活率只有80%左右。并且干冰运输的可靠性也不能完全得到保证,一旦干冰耗尽或者细胞未完全被干冰包裹,细胞的存活率就会直线下降,甚至完全死亡。

     第三个层次是国家质控系统。任何成熟的检测技术都会有相应过国家标准和质控系统。但是由于ELISPOT技术还在发展中,目前世界上还没有任何一个国家建立了ELISPOT技术的国家标准和质控系统。美国是该项工作开展得比较早的国家,目前仍然在不同实验室之间作验证工作,研究建立质控系统的可行性。

     达科为公司于2005年底与我国国家职能部门,国家食品药品监督管理局下设的中国生物制品检定所开展了合作研究。05-06年的研究选定了北京、上海、天津、深圳的11家实验室,冻存细胞在城市内采用了液氮运输的方式,城市间采用了干冰快递的方式。

    如表9.1所示,这是我们一次实验的结果。可以看到,前三个实验室的结果重复性很好,但是第四个实验室的结果明显偏小。


      后面经过仔细排查与验证,是第四家实验室的血球计数板严重不准导致的实验误差。
     综上所述,ELISPOT检测是实验室内部质控系统已经成熟;实验室之间的质控系统需要解决冻存细胞的运输问题;而国家质控系统尚在前期验证、摸索阶段。

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