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WB实验步骤

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130508 打印 字体:  
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1、蛋白样品的制备:通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

2、做胶:检测抗原10-30kd, 用15%分离胶;30-100kd, 用10%分离胶;100-200kd,用7.5%分离胶。

3、跑胶:压缩胶电压:80V(10mA);分离胶电压:120V(20mA)当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时,即停止电泳。

4、转膜:目的蛋白分子80-140kDa时,胶浓度8%,转移时间为1.5-2小时;目的蛋白分子25-80kDa时,胶浓度10%,转移时间为1.5小时;目的蛋白分子15-40kDa时,胶浓度12%,转移时间为0.75小时;目的蛋白分子<20kDa时,胶浓度15%,转移时间为0.5小时;

5、封闭:脱脂奶粉(5%)、BSA、Western Blot 膜封闭液

6、一抗杂交:5%奶粉或2%BSA稀释抗体(称一抗),稀释比例按抗体说明,室温孵育1hr,TBST 洗5 mins 3-5 次。

7、二抗杂交:将膜跟5%奶粉或2%BSA稀释的2 抗一起孵育,室温1hr。TBST 洗5 mins 3-5 次。

8、底物显色:

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