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IHC实验步骤

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130408 打印 字体:  
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标本:组织标本:石蜡切片(病理切片和组织芯片)、冰冻切片细胞标本:组织印片、细胞爬片、细胞涂片

操作步骤:

①石蜡切片制作

1、固定:取组织,用PBS冲洗,放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h

2、脱水:倒去固定液,用蒸馏水冲洗3次,再用50%酒精冲洗2次,用酒精逐级脱水,70%酒精1天,80%酒精过夜,95%酒精3h,无水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2h

3、透明:1:1无水酒精二甲苯45min,二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)各30min

4、包埋:(恒温箱内进行)浸入石蜡,1:1二甲苯石蜡(58℃)45min,石蜡(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)共2.5h,用石蜡(Ⅲ)包埋组织

5、切片:包埋后的组织块经修整后,用切片机切成5-7μm,的石蜡带

6、贴片:将组织石蜡块在50℃温水中展片,然后用处理干净的载玻片捞片,组织带可黏在载玻片上

(洗片:1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶:防脱剂多聚赖氨酸)

7、烤片:68℃恒温箱内烤片2h

②SP三步法

1、脱蜡:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min,或60℃恒温箱中烘烤20min,后用二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)浸泡,共25min

2、水化:无水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2min,下行至95%、80%、70%酒精(Ⅰ)(Ⅱ)各2min

3、PBS冲洗2-3次,每次5min

4、阻断:3%H2O2去离子水(或80%甲醇)孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性

5、PBS冲洗2-3次,每次5min

6、抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温

7、PBS冲洗2-3次,每次5min

8、封闭:滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育20min,甩去多余液体

9、滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1h,或者37℃1h,或者4℃过夜(需在37℃复温45min)

10、PBS冲洗2-3次,每次5min

11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40~50μl,室温静置1h,或37℃1h

12、PBS冲洗2-3次,每次5min

13、滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶),室温或37℃孵育30min-1h

14、PBS冲洗2-3次,每次5min

15、显色:DAB显色5-10min,在显微镜下掌握染色程度(胞浆呈棕色者判定为阳性细胞)

(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)

(A:DAB  B:H2O2 C:磷酸缓冲液)

16、自来水冲洗10分钟终止反应

17、复染:苏木精复染2min,盐酸酒精分化

18、自来水冲洗10-15min

19、常规脱水、透明、封片(用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上)、镜检

③结果分析:每张切片选择5个高倍镜视野(400X),应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。

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