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常见多功能型分离液的配置方法

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20210806 打印 字体:  
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OptiPrep™是Serumwerk Bernburg AG的一款多功能分离液,Serumwerk Bernburg成立于1954年,是一家现代化的、专门的生产商和服务商。OptiPrep生产、包装、发布严格按照GMP和ISO13485标准执行。

 


OptiPrep

OptiPrep™是Serumwerk Bernburg AG的一款多功能分离液,其主要成分是60%碘克沙醇。密度为1.32 g/ml,可以用来分离多种种属、以及多种细胞、病毒、蛋白质、核酸等不同颗粒。OptiPrep不含多糖,对靶细胞无毒副作用,且内毒素含量<0.13EU/ml,远低于欧洲标准(1EU/ml)。


配制不同密度的OptiPrep:

使用密度溶液的配制方法,是基于使用0.85% (w/v) NaCl, 10 mM Tricine-NaOH, pH 7.4作为细胞悬浮培养基。为了使溶液在任何梯度下都保持浓度恒定,首先将4体积的OptiPrep™与2体积的溶液A (3倍浓度的缓冲液) 混合,来制备40% (w/v)的碘克沙醇工作溶液(WS)。然后,使用溶液B进一步稀释碘克沙醇工作溶液,以获得适当密度的梯度溶液,常见的密度配制见表1。

 

注:HEPES/Tricine可以被其它有机缓冲液替代。如果溶液B中需要添加低浓度(1-2mM)的其它物质,如Mg2+或Ca2+,可以在溶液A也添加3-6 mM,以保持其在梯度中不变,如果不需要维持溶液恒定或二价阳离子浓度恒定,OptiPrep™可以直接用溶液B稀释(含有或不含低浓度的二价阳离子),所获得的梯度溶液的密度和折射率与表1相比可能会有微小的差异,所有梯度溶液的渗透压都在285-305 mOsm范围内。

 

PS:使用等渗盐溶液和培养基配制、使用含血清的培养基配制方法请参考往期文章:

OptiPrep™的应用——不同密度梯度溶液的配制(关注下方“达科为生物城”公众号)

 

OptiPrep渗透压(约为290 mOsm/kgH2O)与血浆渗透压(约为300mOsm/kgH2O)相近,较少考虑平衡渗透压,在使用相同稀释溶液的情况下,分离液密度与碘克沙醇的百分比成正比。
 

 

Percoll

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮——polyvinylpyrrolidone (PVP)的硅胶颗粒的水溶液。渗透压很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小,密度为1.3g/ml左右。所以配置前要调整渗透压。


配制不同密度的Percoll:

Percoll具有非常低的渗透压(< 25mOsm /kg H2O),配制不同Percoll时需要注意调整渗透压。将9份Percoll (v/v)加入1份1.5 M NaCl (v/v)或10倍浓度的细胞培养基中,制备等渗Percoll储存液(SIP,Percoll Stock Isotonic Percoll)。对于对离子敏感的亚细胞粒子,可以通过将9份Percoll (v/v)加入1份2.5 M蔗糖(v/v)来制备蓄积等渗Percoll (SIP)。


 

不同等渗溶剂配置的 Percoll 储存液具有不同密度

 

稀释储存液SIP以降低密度只需添加0.15 M NaCl(分离亚细胞颗粒或病毒时加入0.25 M蔗糖溶液),可将等渗Percoll(SIP)的溶液稀释至较低的密度进行分离细胞。以下公式可用于计算获得所需密度的溶液所需各组分的体积。
 

 

其中Vy =稀释用等渗溶剂的体积(mL)

Vi = SIP的体积(mL)

ρi = SIP的密度(g / mL)

ρy =稀释用等渗溶剂的密度(g / mL)

(0.15 M NaCl的浓度为1.0046 g / mL,0.25 M蔗糖的密度为1.032 g / mL)

ρ=最终溶液的密度(g / mL)

 

例如

要将55 mL的SIP稀释至1.07 g / mL的最终密度,计算所需的0.15 M NaCl量。

所需0.15 M NaCl的体积= 55×(1.123-1.07)/(1.07-1.0046)= 44.6ml

用等渗盐水或蔗糖溶液稀释Percoll储存液 (SIP)。ρ0是Percoll原液的密度

注意:百分比是Percoll储存液的体积占比

 

以0.15M NaCl作为等渗溶液稀释Percoll密度与百分比的对应表。(来源于网络仅供参考)

 

上面的公式可用于获得非常接近所需实际密度的密度。但是,轻微的稀释介质的体积 和密度的变化会影响最终密度。

 

OptiPrep VS Percoll配比参照表




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