这种阴选方法快速简单，10分钟得到想要的活性细胞！
在细胞分选中，阴选通常是指对非目的细胞进行标记和去除，来得到目的细胞。避免通过直接的标记目的细胞（比如使用表面特异性抗体标记），从而来减少细胞活化可能。因此，阴选方法的优势在于可以保持目的细胞未受刺激的原始状态，分选速度快。不过相对阳选而言纯度稍低，而且需要事先对原始样品的细胞组分有所了解，准备相应的标记抗体。
本文将分享一种新的阴选方法和相关数据，利用Strep-Tactin®TACS的琼脂糖层析柱，这种层析柱既可用于细胞阳选，也能用于细胞阴选中。
为了评估Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱细胞阴选的效率，实验从外周血单个核细胞（PBMC）样品中富集了CD3- CD56+自然杀伤细胞（NK）。材料为Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱以及生物素化的抗体，仅10分钟，便完成了细胞阴选 （图1）。
流程如下
阴选流程：生物素化抗体与PBMC孵育标记非目的细胞，加入至亲和层析柱后，即可收集目的细胞
- 将1 x 107 的PBMC细胞用100μl的Buffer稀释（Buffer CI：含0.5％ BSA的PBS缓冲液，1 mM EDTA）
- 加入多种生物素化抗体，室温下孵育5分钟。生物素化的抗体包含以下几种，每种抗体0.5 μg：CD235a (erythrocytes), CD14 (monocytes), CD3 (T cells), CD15 (granulocytes), CD19 (B cells), CD36 (thrombocytes), CD123 (hematopoietic stem cells) 和CD279 (PD-1)。
- 将孵育好的样品加入到1 ml的Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱上（柱子最大结合能力：1 x 108个细胞）。
- 当样品完全进入柱子后，加入10 ml Buffer洗脱两次，就可以得到未结合的细胞了。后续使用流式细胞术检测富集的NK细胞。
（此处用到的试剂见文末）
结果与讨论
通过使用阴选将非目的细胞去除后，获得了高纯度的目的细胞群。实验用到了Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱，并进行了两次独立实验。结果如图2所示。 NK细胞从6％的起始丰度（图2A）通过富集达到了86％（图2B）。所有抗体标记的细胞群几乎均去除，剩余的非NK细胞主要成分为未标记的细胞。数据表明， Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱不仅可以在阳选中使用，还可以搭配适当的抗体标记，有效进行细胞阴选。
图2：通过阴选富集PBMC中的CD56 + NK细胞。Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱与生物素化抗体结合，从而实现NK细胞的富集，纯度从6％（A）提高到86％（B）（n = 2）
实验材料
为什么使用Strep-Tactin®TACS？实验中使用的Strep-Tactin®TACS亲和层析柱，主要成分Strep-Tactin®是链霉亲和素（Streptavidin）的一种突变体，借助链霉亲和素-生物素作用原理，Strep-Tactin®与生物素（biotin）的亲和力介于100 pM – 100 fM间。当向含有的Strep-Tactin®层析柱中加入生物素化的抗体时，便能将其固定在柱子中，特异性捕获细胞，进行阴选。
抗体的选择
实验中可以选择的抗体有亲和力较高的生物素化单克隆抗体（图3A），或带有Twin-Strep-tag®的抗体，如图3B所示。带Twin-Strep-tag®的单克隆抗体在生产和纯化更便捷，还可以通过加入生物素来洗脱已经结合在柱子上的细胞。并且，Twin-Strep-tag®的单克隆抗体的位置相对更固定一些。
使用生物素化抗体好处在于其与Strep-Tactin®的亲和力相比之下更高，可以稍提高阴选效率，但是总体来说两种类型的抗体对细胞阴选都是非常有效的。
图：单克隆抗体用生物素（A）或Twin-Strep-tag®（B）标记，两种都可以固定在Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱中。
总而言之，作为灵活的细胞研究工具，Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱在细胞分选的应用不仅限于阳选，还可以在阴选中结合多种生物素化抗体（或Twin-Strep-tag®标记的抗体）一起使用。整个细胞分选过程只需10分钟，是一种快速有效的细胞阴选方案。
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