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这种阴选方法快速简单,10分钟得到想要的活性细胞!

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20210728 打印 字体:  
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在细胞分选中,阴选通常是指对非目的细胞进行标记和去除,来得到目的细胞。避免通过直接的标记目的细胞(比如使用表面特异性抗体标记),从而来减少细胞活化可能。因此,阴选方法的优势在于可以保持目的细胞未受刺激的原始状态,分选速度快。不过相对阳选而言纯度稍低,而且需要事先对原始样品的细胞组分有所了解,准备相应的标记抗体。

阴选的优势与劣势

 

本文将分享一种新的阴选方法和相关数据,利用Strep-Tactin®TACS的琼脂糖层析柱,这种层析柱既可用于细胞阳选,也能用于细胞阴选中。
 

 

为了评估Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱细胞阴选的效率,实验从外周血单个核细胞(PBMC)样品中富集了CD3- CD56+自然杀伤细胞(NK)。材料为Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱以及生物素化的抗体,仅10分钟,便完成了细胞阴选 (图1)。
 

流程如下


 

阴选流程:生物素化抗体与PBMC孵育标记非目的细胞,加入至亲和层析柱后,即可收集目的细胞

实验方案
CD3- CD56+ NK的细胞阴选
  • 将1 x 107 的PBMC细胞用100μl的Buffer稀释(Buffer CI:含0.5% BSA的PBS缓冲液,1 mM EDTA)
  • 加入多种生物素化抗体,室温下孵育5分钟。生物素化的抗体包含以下几种,每种抗体0.5 μg:CD235a (erythrocytes), CD14 (monocytes), CD3 (T cells), CD15 (granulocytes), CD19 (B cells), CD36 (thrombocytes), CD123 (hematopoietic stem cells) 和CD279 (PD-1)。
  • 将孵育好的样品加入到1 ml的Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱上(柱子最大结合能力:1 x 108个细胞)。
  • 当样品完全进入柱子后,加入10 ml Buffer洗脱两次,就可以得到未结合的细胞了。后续使用流式细胞术检测富集的NK细胞。 

(此处用到的试剂见文末)

 

结果与讨论

通过使用阴选将非目的细胞去除后,获得了高纯度的目的细胞群。实验用到了Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱,并进行了两次独立实验。结果如图2所示。

NK细胞从6%的起始丰度(图2A)通过富集达到了86%(图2B)。所有抗体标记的细胞群几乎均去除,剩余的非NK细胞主要成分为未标记的细胞。数据表明, Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱不仅可以在阳选中使用,还可以搭配适当的抗体标记,有效进行细胞阴选。
 

图2:通过阴选富集PBMC中的CD56 + NK细胞。Strep-Tactin®TACS琼脂糖柱与生物素化抗体结合,从而实现NK细胞的富集,纯度从6%(A)提高到86%(B)(n = 2)

 

实验材料

为什么使用Strep-Tactin®TACS?

实验中使用的Strep-Tactin®TACS亲和层析柱,主要成分Strep-Tactin®是链霉亲和素(Streptavidin)的一种突变体,借助链霉亲和素-生物素作用原理,Strep-Tactin®与生物素(biotin)的亲和力介于100 pM – 100 fM间。当向含有的Strep-Tactin®层析柱中加入生物素化的抗体时,便能将其固定在柱子中,特异性捕获细胞,进行阴选。

 

抗体的选择

实验中可以选择的抗体有亲和力较高的生物素化单克隆抗体(图3A),或带有Twin-Strep-tag®的抗体,如图3B所示。

带Twin-Strep-tag®的单克隆抗体在生产和纯化更便捷,还可以通过加入生物素来洗脱已经结合在柱子上的细胞。并且,Twin-Strep-tag®的单克隆抗体的位置相对更固定一些。

使用生物素化抗体好处在于其与Strep-Tactin®的亲和力相比之下更高,可以稍提高阴选效率,但是总体来说两种类型的抗体对细胞阴选都是非常有效的。
 

图:单克隆抗体用生物素(A)或Twin-Strep-tag®(B)标记,两种都可以固定在Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱中。


总而言之,作为灵活的细胞研究工具,Strep-Tactin®TACS琼脂糖层析柱在细胞分选的应用不仅限于阳选,还可以在阴选中结合多种生物素化抗体(或Twin-Strep-tag®标记的抗体)一起使用。整个细胞分选过程只需10分钟,是一种快速有效的细胞阴选方案。

 

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