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细胞凋亡的早期检测方法有哪些?

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130718 打印 字体:  
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1、PS(磷脂酰丝氨酸)在胞外膜分布的检测
PS从胞膜内侧转移到外侧现象是在细胞凋亡的早期即可发生标志。AnnexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在胞膜外侧的PS,使用荧光素标记的AnnexinV 蛋白(如Annexin V-FITC)即可检测细胞凋亡。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测(悬浮细胞和贴壁细胞都适用),可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。操作简便快速,10分钟就可完成检测。灵敏度高,可作为流式方法分析凋亡细胞的基础。

2、细胞内氧化还原状态改变的检测
正常状态下,谷胱甘肽(GSH)作为细胞内的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而清除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被消化除。在细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C(三羧酸循环中的重要组分)从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应。

3、细胞色素C的检测
细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,而不存在于胞浆内。凋亡信号刺激后可使其从线粒体释放到胞浆中,结合Apaf-1后而启动caspase级联活化反应,首先可激活caspase-9,后者再激活caspase-3和下游的其它caspase分子。凋亡发生的早期,细胞色素C泄漏到胞浆中,检测胞浆中细胞色素c的含量可反映细胞的早期凋亡。

4、线粒体膜电位变化的检测
在细胞凋亡的早期,线粒体在形态学上没有明显变化。但线粒体可发生很多生理生化的改变。例如在受到凋亡诱导后,线粒体的转膜电位发生变化,导致膜穿透性改变。MitoSensorTM是一种阳离子染色剂,对此膜电位改变非常敏感,可呈现出不同的荧光染色。正常细胞中,它在线粒体中形成聚集体,发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中,因线粒体跨膜电位改变,它则以单体形式停留于胞浆中,发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。

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