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细胞凋亡检测技术与方法

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130718 打印 字体:  
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      细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间,但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用,引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究,成为目前生命科学界最为热门话题之一,也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到,信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的,而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温,涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测,其中不少已经有商品化的产品出现,大大加速了研究的进程。具体来说,针对凋亡的不同阶段有以下一些方法:

 

       1. 早期检测:


        1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:


        PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV,一个钙依赖性的磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在膜外侧的PS,再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测(悬浮细胞和贴壁细胞都适用),可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。


        BioVision公司位于美国加州,是世界上首屈一指专着于凋亡和细胞信号研究的公司。其产品质优、价廉、包装使用方便。BioVision提供多种标记的Annexin V产品,并有与核染料PI组成完整早期凋亡检测试剂盒。


        BMS(Bender Medsystems)公司拥有Annexin V专利权,可提供各种规格的Annexin V凋亡检测试剂盒。其中Annexin V FITC试剂盒中包含Annexin V和核染料PI,且具小包装,适合检测小样本的客户。


       另外,Biovision公司和德国美天妮公司提供磁珠包被Annexin V,可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。


        2)细胞内氧化还原状态改变的检测:


       正常状态下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中,细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C(三羧酸循环中的重要组分)从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应。


       由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关,此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外,还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如:HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化,不能用此法检测。


       3)细胞色素C的定位检测


       细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液,结合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后启动caspase级联反应:细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。


       细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在线粒体内膜上的膜蛋白,凋亡发生时,它保留在线粒体内,因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。Cytochrome c Apoptosis Assay Kit试剂盒可以有效地检测凋亡过程中细胞色素c的释放情况。


       4) 线粒体膜电位变化的检测:


       在凋亡研究的早期,从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入,发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分,发生很多生理生化变化。例如,在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化,导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM,一个阳离子性的染色剂,对此改变非常敏感,呈现出不同的荧光染色。正常细胞中,它在线粒体中形成聚集体,发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中,因线粒体穿膜电位的改变,它以单体形式存在于细胞液中,发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。Biovision公司的MitoCaptureTM Mitochondrial Apoptosis Detection Kit(MitoCaptureTM线粒体凋亡检测试剂盒)可以简单、灵敏地体外分析、检测线粒体在凋亡过程中的变化。

 

        2. 晚期检测:
 

      细胞凋亡晚期中,核酸内切酶(某些Caspase的底物)在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。


        1) 凋亡 DNA Ladder 检测试剂盒


       细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit可以快速(约1-2小时)、灵敏地检测凋亡细胞中的DNA片段。


       2) TUNEL-based DNA 片段分析试剂盒


       细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测。Apo-BrdUTM分析使用2种颜色的TUNEL方法用流式细胞仪检测凋亡细胞中DNA条带。采用的BrdU比生物素标记的或地高辛(digoxigenylated)标记的方法灵敏度更高。新增的ApoBrdU-IHCTM是一种完整的试剂盒用于双色的免疫组化(IHC)检测DNA片段。Apo-DIRECTTM是非常简单的一步标记凋亡细胞,用于流式细胞术分析。


       3)Caspase分析试剂和试剂盒


        Caspase在细胞凋亡中发挥着重要的作用,属于天冬氨酸蛋白酶。其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。在正常状态下,caspase家族都以无活性的酶原(30~50kD)形式表达,Caspase酶原由原结构域、大亚基(~20kD )和小亚基(~10kD )构成。当细胞发生凋亡时caspase可以被蛋白酶裂解,大亚基和小亚基形成活化的caspase。一些caspase活化后可以次序激活其他caspase形成caspase级联反应,促发细胞凋亡。


       Biovision公司作为世界领先的细胞凋亡试剂研发和供应商,可以提供全面的、高质量的caspase相关检测试剂。

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