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ELISA基础知识和常见FAQ（一）

作者：admin 信息来源：达科为日期：2025年05月20日打印字体：大中小

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酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测。

一、应用

免疫细胞胞内外成分测定、自身免疫性疾病诊断、体液/组织液中生物分子定量检测、流行病学检测筛查、环境生态学中微量元素定量、病毒滴定检测、疫苗开发等。

根据样本及抗原抗体结合机制，可将ELISA分为四类：直接法、间接法、夹心法、竞争法。

直接法：将抗原固定于固相载体上，加入酶标记的一抗，即可对抗原进行检测

间接法：与直接法类似，将抗原固定于固相载体上，加入一抗，再将针对一抗宿主物种的标记二抗与一抗结合进行检测

夹心法：常用于检测大分子抗原。将捕获抗体固定于固相载体上，加入待测样本，再加入标记的检测抗体，即可对抗原进行检测。

竞争法：适合用于检测小分子抗原，可分为直接竞争法和间接竞争法。直接竞争法：将捕获抗体固定于固相载体上，加入酶标记抗原与待测样本，若待测样本中含有抗原，则会与酶标记抗原竞争结合载体上的捕获抗体。间接竞争法：将抗原固定于固相载体上，加入酶标记抗体与待测样本，若待测样本中含有抗原，则会与载体上固定的捕获抗原竞争结合酶标记抗体。

二、实验步骤（以夹心法为例）：

试剂、耗材的准备（板子平衡至室温，buffer的稀释，标准品的溶解等）；
捕获抗体的包被（通常为4°C过夜）；
洗板，洗去未结合的抗体；
封闭，占据未被捕获抗体结合的空隙（有些试剂盒不需要封闭）；
洗板，洗去未结合的封闭剂；
加入样本或标准品（孵育时间参考说明书）；
加入检测抗体（孵育时间参考说明书）；
洗板，洗去未结合的检测抗体；
加入酶标记的二抗（孵育时间参考说明书）；
洗板，移除多余的二抗；
加入底物显色（参考说明书，具体时间根据实验情况调整）；
加入终止液终止显色（终止后迅速检测）；
u 酶标仪测吸光值（双波长检测更准确，450nm检测波长，570nm校正波长）。

三、IFN-γ在免疫和肿瘤中的调节作用:

ELISA常见检测指标有IFN-γ、TNF-α、IL-17A等。其中干扰素-γ（IFN-γ）是一种可溶性细胞因子，在1965年被发现于由PHA刺激的PBMC释放，随后因其对先天和适应性免疫的多效免疫调节作用而闻名。IFN-γ主要由活化的淋巴细胞分泌，如CD4+和CD8+ T细胞，γδT细胞，以及NK细胞和NKT细胞；也可由其他细胞分泌，包括B细胞和抗原呈递细胞（巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞）。IFN-γ能够与IFN-γ受体（IFN-γR）结合，激活JAK信号通路和STAT途径并诱导IFN-γ刺激基因的表达。

IFN-γ信号通路协调多种生物反应，在先天和适应性免疫中扮演的重要角色。IFN-γ可以通过促进Th1细胞、CD8+T淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞及巨噬细胞的活性，抑制Treg、Th2和Th17细胞分化和功能，发挥免疫调节作用。此外，IFN-γ可激活巨噬细胞，使其分化为M1型巨噬细胞。

IFN-γ通过多种方式发挥抗肿瘤作用，包括抗原呈递的调节、促进炎症和趋化信号传导、应答白细胞的激活和极化，以及直接的抗增殖和抗血管生成作用。IFN-γ诱导的CXCL9、CXCL10和CXCL11 可阻断新血管形成，并招募效应白细胞。同时IFN-γ能拮抗抑制性细胞因子的表达（TGF-β、IL-10），并诱导巨噬细胞中IL-12的表达。此外，IFN-γ还可以通过调节肿瘤细胞中凋亡诱导剂（caspase-1、caspase-8、Fas和FasL等）诱导肿瘤细胞凋亡。肿瘤浸润淋巴细胞可分泌IFN-γ使树突状细胞和巨噬细胞抗原呈递作用上调，进而促进T细胞活化所必需的共刺激分子和细胞因子的表达。

另一方面，与抗肿瘤作用相反，IFN-γ还发挥促肿瘤的作用。这种活性主要是由IFN-γ信号敏感性丧失、抗原呈递减少以及IDO和检查点抑制剂的诱导而产生。

四、下面我们对ELISA实验中经常会遇到的问题进行了汇总，快来看看有没有你遇到的问题呢？

常见FAQ:

1、样本中分析物水平较低可以使用哪些方法改进检测？

通过增加洗涤次数和两次洗涤之间的浸泡时间降低背景。

控制测定精确度。例如，在移液时要更加小心和一致，使用干净的纸巾拍板，以避免污染。

增加孵育时间。但这通常也会增加背景，因此检测灵敏度不一定会增加。

如果可以的话，建议浓缩样本。

使用5-PL曲线拟合方法，更准确地计算标准曲线下端的样本浓度。

在大多数情况下，样本可能只含有非常低或无法检测到的分析物水平。这时无论如何操作和测定，仍然无法检测到准确浓度。

2、包板应如何存放？

如果包被完抗体的板不能立即使用，应将其密封并在4°C储存过夜。

3、为什么使用同一克隆号的捕获抗体和检测抗体建立ELISA实验没有成功？

如果使用相同的克隆抗体进行检测和捕获，则抗原表位可能已经被其中一种抗体占据并抑制另一抗体结合。建议捕获和检测抗体选择不同的克隆号。

4、应该使用哪种包被缓冲液？

一般来说，建议使用PBS（pH 7.4）或碳酸盐缓冲液（pH 9.5）。确切的包被缓冲液可能取决于要检测的细胞因子。

5、为什么细胞因子流式染色与ELISA测定之间没有良好的相关性？

流式细胞术检测的胞内细胞因子代表检测时的阳性细胞比例，ELISA代表细胞因子随时间的积累量。可能少量的阳性细胞在一段时间之后会分泌大量的细胞因子于培养上清中,导致ELISA的结果与胞内因子染色的结果不一致

6、可以使用细胞培养板进行ELISA实验吗？

不可以。细胞培养板设计用于达到细胞培养目的，通常不具有高蛋白结合能力。对于ELISA，建议使用具有高蛋白结合能力的板，例如 Nunc Maxisorp™酶标板。

7、血清等样本可以重复使用吗？

不建议重复使用样本。为了获得准确的结果，样本应分装储存，仅供一次性使用。如果重复使用样本，需要进行额外的验证实验，以确保实验准确性。

8、在什么步骤中，可以暂停ELISA实验？可以冷冻板子以备后用吗？

最好遵循说明书操作，没有任何可以暂停实验的步骤。但是，如果一定需要暂停实验，建议在封闭步骤（包被捕获抗体后）。可以在孔中加入200 μL封闭缓冲液，并将板在4°C过夜（信号损失最小或没有）或在-20°C冷冻几天（可能会对信号产生一些影响）。不建议在第一步进行（在4°C用捕获抗体包被超过16-20小时），因为可能会导致高背景。

9、包被捕获抗体可以超过过夜的时间吗？

通常来说，建议在4°C包被16-20小时。较长的孵育时间可能会增加与板结合的捕获抗体量，会增加背景。

10、培养基中的酚红会干扰ELISA测定吗？

不会，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会干扰ELISA测定的读数。

11、对于一些ELISA试剂盒，为什么血清样本需要稀释？

血清样本稀释可以尽量减少样本和标准品之间的基质差异，以获得更加准确的结果。

12、如何提高ELISA检测获得更好的信号和灵敏度？

增加孵育时间，但这也可能会增加检测的背景，同时不改变灵敏度。

在孵育步骤中摇动板子。

确保标准品在使用前完全溶解。

在两次洗涤之间增加浸泡时间，以进一步降低背景。

如果可以的话，在450-570 nm处读板以减去本底。

通过控制移液误差或使用更大体积的洗涤缓冲液洗涤来改善CV值。

使用5-PL或4-PL曲线拟合方法，而不是线性曲线拟合。