如何做好逆转录PCR（一）——影响逆转录的重要因素

逆转录PCR （ RT-PCR ）

逆转录PCR (RT-PCR )具有灵敏性高、操作简单等优点，常用于基因定量分析、生物学检测和克隆特定基因的cDNA序列等方面。

cDNA的合成是RT-PCR 的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法设计两条引物，以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的完整基因的序列。

逆转录PCR 的重要因素

不同的mRNA转录成cDNA的效率不同，适合某一种mRNA转录的条件可能对另一种mRNA不适合，因此，在进行不均一mRNA反转录时，下面的参数非常重要。

一、逆转录酶

常见的逆转录酶有四大类：

• 第一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNase H活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，因此适合用来扩增比较复杂的模板，但是由于AMV具有高水平的RNase H的活性，RNaseH同反转录酶相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA（RNase H可特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA），被降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，所以AMV不适合太长片段cDNA的合成。

• 第二种来源于鼠白血病病毒(MMLV)，它是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNase H活性。该酶最适反应温度为37℃，最适pH为7.6。由于具有较弱的RNase H活性，因此使用该酶能得到较长的cDNA片段（2-3kb），但是MMLV对热的稳定性差。

• 第三种来自Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶，在Mn²⁺存在下，可以高温进行反转录，以消除RNA模板的二级结构。

• 第四种是MMLV反转录酶的RNaseH-突变体，此种酶与其它酶相比，能更多的将RNA转录成cDNA。这一特性使得研究者能从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板中合成较长的cDNA。

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EpiScript™ Reverse RNase H- Transcriptase（Cat# ERT12925K，Lucigen）

1. 是一种重组的MMLV反转录酶，降低了RNase H的活性；

2. 该酶能够高效的从长的RNA模板合成全长cDNA；

3. 比其他MMLV逆转录酶具有明显高的活性；

4. 该酶能够从低至50 pg的总RNA中合成cDNA；

5. 试剂盒中含有10X RT Reaction Buffer和100mM DTT；

二、合成 cDNA的引物

合成cDNA的引物一般分为三大类：

• 随机引物：某些特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列，比较难以转录成全长序列时，可采用非特异的随机引物来转录全长mRNA。选择这种引物，体系中所有RNA分子会全部充当DNA第一链模板，然后PCR引物在下游扩增过程中再扩增特异的目的基因。通常，用此引物合成的cDNA中，96%来源于rRNA。

• Oligo(dT)：绝大多数真核细胞的mRNA具有3’端Poly(A+)尾，所以使用Oligo(dT)仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，所以用这种引物合成的cDNA比随机引物得到的cDNA量少、复杂性小。

• 特异性引物：以目标RNA互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅生成所需要的cDNA，产生PCR产物更为特异。

三、缓冲液及dNTPs

缓冲液中的离子浓度会影响各种模板的转录效率。一般情况下，用钾离子比用钠离子可获得较长的转录产物。另外，使用高浓度、高纯度的四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)对于有效合成cDNA也是特别重要的。

逆转录PCR选择一步法还是两步法？

RT-PCR 的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种：

一步法RT-PCR 能克隆微量mRNA而不需合成cDNA，省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR，即RNA 反转录与PCR 扩增分两步进行。

一步法RT-PCR与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR 反应的错配率。两步法RT-PCR的优势在于可获得中间产物cDNA，便于保存；且第二步PCR只需取逆转录反应产物的1/10进行反应，有利于PCR条件的调整，便于重复试验；两步法可以在第二步PCR反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链cDNA合成和随后的PCR反应，容易产生污染问题。

下一篇我们将分享逆转录PCR实验过程中注意的问题与解决方案，敬请期待哦~

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