如何做好逆转录PCR(二)--提高RT-PCR的特异性

念念不忘，必有回响~继如何做好逆转录PCR（一）——影响逆转录的重要因素（往期微信链接）后，小达君又来继续跟您叨叨逆转录PCR那点儿事了——如何提高RT-PCR的特异性。

一、引物选择

cDNA第一链合成的起始可以使用三种不同的方法：随机引物法、oligo（dT）引物法和基因特异性引物法。各种方法的相对特异性影响了合成的cDNA的量和种类,特异性低的引物，合成的cDNA的量会比较大，种类也比较杂。

(一)随机引物法

随机引物是碱基序列具有随机性的寡核苷酸，其长度通常为6个核苷酸，能够与样品中所有类型的RNA结合。当特定的mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝全长序列时，可采用随机引物来拷贝全长mRNA。随机引物法是三种方法中特异性最低的。使用此方法时，体系中所有的RNA分子都充当了合成cDNA第一链的模板，合成的cDNA中96%来源于rRNA。

(二)Oligo(dT)法

Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，能够与真核mRNA的Poly(A)尾部相结合。这种引物适用于以真核mRNA为模板构建cDNA文库、全长cDNA克隆，不适用于以降解的RNA为模板进行逆转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA 的1-5%， 故这种引物合成的cDNA比随机引物法得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。这种方法比随机引物的特异性高。

(三)特异性引物法

特异性引物法是特异性最高的一种方法，该方法中的引物含有与目标RNA序列互补的寡核苷酸，用此类引物仅合成所需的cDNA。

二、提高逆转录保温温度

较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使两者可以结合。然而，某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度可以提高特异性，尤其在使用基因特异性引物进行cDNA合成时。

三、使用具有较高热稳定性的逆转录酶

热稳定逆转录酶可以在较高温度下保温，以提高cDNA合成的特异性。举个栗子，如果一个基因特异性引物（GSP）的退火温度为55℃，那么使用AMV或M-MLV在37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而， 某些具有强热稳定性的逆转录酶可以在50℃或者更高的温度下进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。

插播一条小广告，小达君为您带来一种真正的热稳定逆转录酶~

RapiDxFire™ Thermostable ReverseTranscriptase是一种显著优于常用的MMLV和AMV逆转录酶的方法，可用于快速合成短cDNA（<1 Kb） 。

产品性能

• 在55-80°C高温下极其活跃：通过各种RNA模板提高cDNA合成的特异性；

• 敏感：在两步RT-qPCR分析中检测≤100拷贝的RNA；

• 反应时间短：简化的RT-qPCR工作流程，5分钟或更短时间内出结果；

• 室温下稳定长达3个月：简化自动化卡座上的设置（无需冷藏），冷藏有限的环境中正常使用，长期储存须保存在-20℃;

• Lyo兼容：酶制剂不含甘油和其他成分，不会干扰下游冻干步骤;

• 批次间重复性：符合ISO 13485质量认证要求.

讲事实，摆证据

• RapiDxFire耐高温逆转录酶在高温下表现佳

• 用RapiDxFire Thermostable RT检测寨卡病毒，效果优异

• 热稳定性强

• 室温下3个月内稳定

不可错过的产品信息

LGC（Lucigen）：Lucigen公司成立于1998年，提供各类用于分子生物学研究相关产品，可以使研究者成功克隆较难克隆的基因。2017年Lucigen收购了Epicentre Technologies基因组试剂盒、酶和辅助试剂等产品线，2018年又被英国LGC公司收购，公司合并后改名为 Biosearch technologies，专注于基因组学研究。目前产品线主要包括：体外转录、基因克隆（BAC克隆试剂盒）、感受态细胞（TG1噬菌体文库构建感受态）、体外扩增、转座子突变、蛋白表达、核酸提取等。