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脉冲场凝胶电泳技术

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20150424 打印 字体:  
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PFGE技术简介

       1984SchwartzCantor发明了交变PFGE技术, 解决了大片段DNA (>40 kb) 差异的问题, 同时提高了DNA的分辨力。此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10MbDNA的能力。这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。


工作原理: 大小不同的DNA 分子在交替变换方向的电场中做出反应所需的时间不同, 一般较小的分子重新定向较快,在凝胶中移动快大的DNA分子比小的DNA分子定向慢, 在凝胶中移动比较慢根据各DNA分子迁移距离的不同从而可以达到分离不同大小的DNA 分子的目的。在所有分子分型方法中,脉冲场凝胶电泳以重复性好、分辨性强,被作为细菌分子分型的PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为细菌分子分型技术的“金标准”,并推荐作为金黄色葡萄球菌等病原微生物分型的标准技术。


PFGE 琼脂糖的选择

       PFGE是以琼脂糖作为支持介质的电泳方法。不同支持物的PFGE其用途及作用效果不尽相同,依据不同的支持物可以将PFGE分为2种。


1SeaKem Gold琼脂糖PFGE

          SeaKem Gold琼脂糖是一种高凝胶强度, 低电内渗 (Electric endosmosis, EEO), 标准胶凝温度的琼脂糖。此凝胶最适于PFGE快速分辨50 kb10 MbDNA和常规电泳方法分辨150 kbDNAPCR产物。其高凝胶强度,使这种琼脂糖在浓度很低(0.5%时容易操作因其低EEO特性,SeaKem Gold琼脂糖中的DNA电泳迁移速度要显著高于常规琼脂糖凝胶,从而允许在常规电泳中分离更大的DNA片段并减少PFGEDNA分离的耗时。因此,这种方法比较常用。 Lonza SeaKem® Gold AgaroseCat# 5015250150

 

2InCert琼脂糖PFGE 

          兆碱基片段DNA制备获准使用的琼脂糖,是一种极为有用的制备PFGE用染色体DNA样品的低熔点琼脂糖研究证实InCert琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA的制备和限制性核酸内切酶反应。吴利先和黄文祥 参照Murray等的方法利用InCert琼脂糖进行PFGE鉴定,并获得sprE基因突变株。Lonza InCert™ Agarosecat# 50121, 50123


PFGE的应用范围:

1. 微生物分子分型;

2. 细胞凋亡检测

3. 临床诊断和治疗;

4. 耐药菌株流行趋势分析;

5. 抗生素敏感株和多重耐药菌株的分子分型。


操作步骤:PFGE的简要操作步骤包括样品的包埋、原位裂解、稀少酶切位点的限制性内切酶对染色体DNA的消化、脉冲场电泳、凝胶的EB染色观察5个步骤。


参考文献

1. 王丽丽徐建国.脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)在分子分型中的应用现状.疾病监测,2006.

2. 刘凯,袁雪姣.肠致病性大肠杆菌分离株的脉冲场凝胶电泳分析.现代预防医,2015.

3. 董栋,商军.脉冲场凝胶电泳技术的应用及其发展趋势.上海畜牧兽医通,2014.

4. 刘志国.崔步云.布鲁菌分子分型方法应用研究进展.中国人兽共患病学,2015.

 

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