ELISPOT标准化的建立

为了实现ELISPOT的标准化，显色最好在恒温箱内进行，温度控制在25°C±5°C，显色25分钟为宜。另外，在37°C显色也是不错的一个方法，但要注意相应的缩短显色时间到12-18分钟，并且显色中勤检查。为了提高ELISPOT检测结果的可重复性，增加实验的可信度，必须建立一套标准化的实验操作规范。标准化的实验操作规范不仅仅是一些实验操作，更是一个系统工程，需要提升到实验室管理与制度架构上来建设。这包括实验室制度的建立，实验人员的培训，实验程序的建立和标准化，实验设备、试剂、耗材的选择与标准化等等。单就实验流程而言，标准化规范从实验样品的采集阶段就开始了，一直延续到整个实验的结束，即数据分析处理的完成。参见图1。

如右图所示，影响到ELISPOT斑点频率的因素很多，我们来逐一分析。

细胞类型
通常我们用来做ELISPOT检测的细胞有血液来源的PBMC和脾脏来源的淋巴细胞。也有的实验者需要用到骨髓细胞。来源不同，细胞的组成就有差别，所以要考虑到这些差别，不能直接作比较。是哪些因素导致了细胞来源不同，ELISPOT结果就不同呢？

一个因素是阳性细胞在生物体内的分布。我们知道，细胞免疫往往发生在局部的免疫反应部位。比如发生粘膜免疫时，各种免疫细胞就会富集在粘膜器官；发生自身免疫反应时，致敏细胞也往往集中在受累器官。所以，局部器官的淋巴细胞中阳性细胞的比例与血液或者脾脏中阳性细胞占淋巴细胞的比例可能是不相同的。血液与脾脏之间也可能有差别。

另一个因素是APC的含量。不同组织器官来源，甚至不同的分离方法，在淋巴细胞中混合的APC细胞含量也有差异。极端情况（比如待测细胞是经过磁珠纯化的）APC含量不足，需要添加APC（人工培养的DC细胞或者“饲养细胞”）。这方面的详细情况参见第四节。 
所以，标准化必须考虑细胞类型和细胞组成。

细胞状态
细胞状态是体现实验者技术水平与经验实力的试金石。很多实验者问我，为什么有些人的ELISPOT结果做得非常好，而另外有些人的结果却做得非常糟。略去客观因素不谈，主观因素主要体现在对检测细胞的处理上。有些人有长期养细胞和做细胞学实验的基础，处理细胞来得心应手，获得的细胞状态好，活力高，ELISPOT检测的结果自然就好。反之，有些细胞还没拿去做ELISPOT检测之前，已经被折腾得死去大半或者奄奄一息了，这样能做出好的实验结果来吗？！

细胞状态涉及到细胞来源（包括组织取样）、细胞分离的方法、以及细胞是否需要冻存复苏等诸方面。关于保持良好细胞状态的内容参见第四节；关于细胞分离方法的内容参见第六节；关于细胞冻存复苏方面的内容参见第七节。

这些环节都要做到标准化，细胞状态才有保证，实验结果的重复性与可信度才有保证。

细胞计数
细胞计数看起来很简单，很多实验者都忽视它。但是它对ELISPOT结果可信度与重复性的影响是怎么强调也不过分的。因为ELISPOT检测的是细胞频率，分子式斑点的数目，分母是细胞的数目。如果经过千辛万苦，我们把分子（也就是斑点）弄得很漂亮，也弄得很准确，但是分母却给忽略了，那这个分数值（阳性细胞频率）能准确吗？

我们达科为对此有刻骨铭心的感受。我们公司在05-06年曾经有一个ELISPOT研究项目，就是研究相同的冻存细胞与刺激物在不同的实验室是否能做出相同的结果。我们下了很大的功夫去研究细胞的冻存、复苏，研究冻存细胞在国内的长途运输，也下了很大功夫去培训参与实验的各个实验室的人员技术与资质。最后做出来的实验结果单从斑点与背景上来看无可挑剔，但是有两个实验室的数据与其它八个实验室的数据有较大差异。最后经过详细的排查，原因竟然出现在血球计数板上！这两家实验室的血球计数板质量差，误差大，导致最后细胞计数误差竟然达到±40%！

细胞计数最常见的装备是血球计数板，虽看看起来不是什么高、精、尖设备，但是也代表了一个国家玻璃精加工的水平。我国能够研制精密的大功率固体激光器，也有水平做出高质量的血球计数板。可惜的是有能力不一定有愿望，目前国产的各种血球其数板经过测试都存在较大的误差。建议还是购买进口的血球计数板，确实好用。如果一定要用国产的，那请坚持使用同一块血球计数板。

细胞稀释也必须认真仔细，取样之前注意混匀。做重要实验的时候，最好让两个人独立稀释和计数，结果相差要控制到10%以内。

刺激物、试剂盒与血清
实验要取得重复性，刺激物的刺激效果必须要可重复、可再现。一批刺激物用完之后，换下一批刺激物的时候，要做验证性试验。另外，有些多肽、蛋白类的刺激物可能在保存的过程中会失活、降解，反复冻融也会造成问题。这就要求预先拟定好刺激物的保存计划，时隔三个月或者半年就要做一次验证性的实验。相关内容参见第四节。

目前市场上的ELISPOT试剂盒都是来自国际知名的公司，不同公司的试剂盒采用的抗体质量都是有保证的。但是大家往往忽略了抗体之外的其他成分，比如封闭液、抗体稀释液等等。这些也辅助试剂会造成显著的差别。在追求实验结果的重复性与可信度的时候，必须引起重视。

血清与内毒素当然是一个重要影响因素，为了实现ELISPOT标准化，提高实验的可信度与重复性，根本之道是采用无血清ELISPOT技术。相关内容参见第三节和第五节。

实验操作流程与斑点显色
本手册的第三节就是ELISPOT标准化的操作流程，只要遵照执行，应该没有什么问题。但是有一点需要引起重视，那就是标准化同时也是固定化。往往一个实验操作步骤有很大的弹性空间，可以这样做也可以那样做。如果较真起来，这些做法都有像它的道理，理论与实验也不能证明谁比谁更优。这才是他们得以同时保留下来的原因。但是一旦实验室的操作方法固定下来，就不要随意更改，即便是“等效”的操作也不要随意变化。标准化其实也是固定化。只要标准操作方案没有错误，就要严格执行。

斑点显色之所以从实验流程中单列出来，是因为它的重要性。目前ELISPOT有三套显色系统，一套是PVDF膜上的HRP/AEC显色系统，显红色的斑点；一套是PVDF膜上的AP/BCIP·NBT显色系统，显蓝色的斑点；一套是透明板上的GABA/银染系统，显黑色的斑点。应该说这些显色系统之间的灵敏度与背景控制都没有显著的差别，但是一旦选定一种显色系统之后，最好长期坚持，以满足标准化的需要。 
显色问题除了显色系统的选择之外，还要注意显色温度与显色时间。显色是所有ELISPOT操作中唯一在“室温”完成的操作步骤。但是，请注意生物学与化中的“室温”是有严格所指的25°C±5°C，而不是笼而统之的所谓“室内温度”。进入秋冬季以来，我们接到大量客户电话，说ELISPOT斑点颜色浅，怀疑是不是抗体失活。有意思的是，这些客户多数集中在长江流域。经过仔细核实，他们的问题几乎都是由于冬季室内没有暖气，室温过低导致的显色不足。特别注意：一旦显色进行了10分钟以上，再提高温度就没什么意义了，因为酶已经大部分失活。

为了实现ELISPOT的标准化，显色最好在恒温箱内进行，温度控制在25°C±5°C，显色25分钟为宜。另外，在37°C显色也是不错的一个方法，但要注意相应的缩短显色时间到12-18分钟，并且显色中勤检查。

斑点计数与数据处理
什么样的点判定为ELISPOT有效斑点，什么样的点不判定或者盘点为无效点，这就是斑点计数的“尺度”。为了实现标准化，必须统一“尺度”，不能搞“双重标准”。统一尺度的前提是采用机器自动计数。例如在BioReader4000上，我们一共有十多项独立的参数，用来描述和判定斑点。这些参数可以单独保存为“方法文件”。只要“方法文件”中的参数相同，斑点计数的“尺度”也就相同，标准化的斑点计数就有保障。

数据处理，包括数据综合，阴阳性判断，数理统计等等。不论怎么处理，应该采取相同的处理方法，这没有疑问。

综上所述，ELISPOT标准化的思想就是：在ELISPOT实验的每一个环节都采用切实有效的步骤和方法，并且固定下来，从而最终保证实验结果的重复性与可信度。