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ELISPOT结果分析之——细胞数与斑点频率

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130830 打印 字体:  
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ELISPOT检测的是阳性细胞的频率,也就是出斑点的细胞占整个加入细胞的比例。不仅要计数斑点,也要计数孔中加入的细胞。每孔加入的细胞有一个上限,大约是60万,这是96孔板每个孔能容纳的细胞极限,超过这个极限,细胞就不再单层平铺在孔底了。而ELISPOT检测的前提条件是细胞单层平铺在孔底。

理论上说,同一次实验,孔内的斑点数量应该和加入孔中的细胞数量成正比,不论加入细胞多少,阳性细胞的频率是恒定的。正是基于这一前提,ELISPOT检测的单位被定义为,每百万细胞中阳性细胞的数目,英文SFC/Million (Spots Forming Cells per Million cells)。

但是实际情况究竟怎样呢,斑点数量真的和细胞数量成正比吗?

经过反复的实践,我们发现这条规律只有在特定的前提下才成立。这个前提就是有足够的抗原呈递细胞(APC)密度,以满足细胞间的相互作用。由于特异性的ELISPOT反应都需要APC把抗原呈递给T细胞,所以只有APC充足的时候,斑点数目才和细胞数目成正比。

通常的ELISPOT检测是不单独制备APC的,而是依靠混合在淋巴细胞中的APC担负抗原呈递的作用。好在PBMC和小鼠脾脏淋巴细胞都含有足够的APC,在特定的细胞浓度下都会发挥正常的抗原呈递功能。另外,不同的刺激物类型对APC的要求也不一样,需要具体情况具体分析。


非特异性刺激物


非特异性的刺激物可以直接刺激淋巴细胞,这种刺激不依赖于APC或者其它辅助细胞,是单细胞反应行为。所以它对细胞密度没有要求,在极宽的细胞浓度范围之内——多至40万/孔,低至5千/孔——斑点数量和细胞数量都有简单的正比例关系,参见图4.2。但是考虑到,只有恰当的斑点数目才便于数据统计,所以推荐细胞密度为10万/孔。如果细胞数目过多,满孔都会被斑点覆盖,并且相互重叠。



T细胞表为肽/CEF/ICE

T细胞表位肽比较特殊。一方面,它需要APC的呈递,是双细胞反应行为;另一方面它不需要APC的加工,对于APC的依赖相对较低。以使用ICE多肽库为例,实践中我们发现在5万/孔—60万/孔的细胞浓度范围内,都可以获得很好的斑点数与细胞数的线性关系(参见图4.2)。通常我们推荐20万/孔的细胞密度。如果在这样的细胞密度下,斑点过多或者过少,可以根据实际情况,在线性范围许可的限度内减少或者增加每孔种植的细胞密度。


普通多肽/蛋白/组织提取物

不论是普通多肽(比如重叠多肽库)还是蛋白质或者蛋白类的组织提取物,这些刺激物都需要APC的摄取、内化、加工、呈递,之后T细胞才能被刺激。所以,使用这些刺激物的时候,一定要保证足够的细胞密度。根据我们的经验,细胞密度要至少达到20万-30万每孔。多肽推荐的细胞密度为30万/孔,蛋白推荐的细胞密度为40万/孔。也可以根据实际情况,在线性范围内调整,参见表4.1与图4.2。

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