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Western blot 实验技术及常见问题分析

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20141211 打印 字体:  
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Western blot基本原理:

在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。


Western blot应用:

目的蛋白的表达特性分析;

目的蛋白与其他蛋白的互作;

目的蛋白的组织定位;

目的蛋白的表达量分析;


Western blot一般流程:


蛋白样品的制备:

1 水溶液提取法:稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解  度大,是提取蛋白质最常用的的溶剂,操作相对麻烦,重复性一般;

2 有机溶剂提取法;

3 离心管柱提取法:超快速,易用,高产及重复性强;

4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。


Western blot注意事项和常见问题:

1 我的细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢?

答:有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长; 也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。

 

2 我做的蛋白质分子量很小(10 KD),请问怎么做WB?

答:可以选择0.2 μm的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。

 

3 最后显色时用 DAB好还是ECM好?

答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP 最敏感的底物;ECM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级蛋白,具体可以根据你实验的情况。

 

4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和western blot试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?

答:①免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Western  blot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定 量,但是不能定位。

   ②两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

 

5 细胞水平要做western blot,多少细胞提的蛋白够做western blot?

答:一般5×106就足够了。

 

6 同一样品能同时提RNA又提蛋白么?这样对western blot有无影响?

答:能,没有问题。


7 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?

答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。

 

8 蛋白变性后可以存放多久?

答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。


9 二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?

答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点。

 

10 做组织样品的western的时候,怎样处理样品?

答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性。


11 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?

答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。


12 在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

 

13 检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗?

答:可以。


14 蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?

答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12%SDS-PAGE,湿转120mA, 45-60min就可以了, 可以根据你实验室的经验调节;170kd 用 7% SDS-PAGE,200mA 90-120min。


15 细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?

答:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。

 

16 PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

 

17 westernblot内参选择什么合适?

答:这与目标抗原的表达位置有关,对于胞浆和全细胞蛋白,可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin;线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV;核内抗原可以选择内参Lamin B1、TBP和histone。


18 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低?

答:转移缓冲液中加入20% 甲醇(终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也能增加转移效率;使用戊二醛交联;降低凝胶浓度,如低至6-7%或提高转膜电压/电流,增加转移时间。

 

19 转膜时凝胶肿胀或卷曲?

答:可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。

 

20 跑胶的条带歪斜或者漂移?

答:电转仪长期使用导致海绵变薄,“三明治”结构不紧凑导致,可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。

 

21 转膜后膜上有单个或多个白点?

答:转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。

 

22 转膜缓冲液过热?

答:缓冲液中离子浓度太低,电流或者电压过高,转膜过程中注意降温。

 

23 显影后胶片背景太高?

答:转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿;洗膜不充分,可以增加膜洗涤次数;封闭不完全,选择合适的封闭液和提高封闭时间;二抗浓度过高,降低二抗浓度;一抗特异性不强,换用特异性较强的单克隆抗体;曝光时间过长,减少曝光时间。

 

24 结果没有条带或者条带很浅,杂交信号很弱?

答:样品中不含靶蛋白或者含量太低,可增加蛋白上样量,设置已知标准量蛋白的对照;抗体稀释比例太低,孵育时间不够;转膜不好,转膜后可先用丽春红染色观看染色效果;曝光时间过短,增加曝光时间;抗体保存不当,效价降低。

 

25 目的条带位置偏低或者偏高?

答:胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶,小分子蛋白要用高浓度胶。


26 有非特异性条带?

答:目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带;一抗特异性不好,换用特异性较好的单克隆抗体;二抗非特异性引起的结果,可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合;样品蛋白质可能降解,提取蛋白时注意冰上操作,加入适当的蛋白酶抑制剂,避免样品反复冻融;抗体浓度过高,降低一抗和二抗的浓度。

 

27 胶片是一片空白,是怎么回事?

答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。     二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;ECM底物中H2O2,不稳定,失活;ECL底物没覆盖到相应位置;二抗失活。

 

28 目的条带是白色,周围有背景?

答:目的蛋白含量太高;一抗浓度偏高,二抗上HRP催化活力太强。

 

 

 

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