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免疫沉淀技术

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130718 打印 字体:  
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免疫沉淀原理:
免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如“proteinA”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的分离抗原的免疫学方法。目前多用的“proteinA”等预先结合固化在Agarosebeads上,使之与含有抗原的溶液几抗体反应后,beads上的proteinA就能吸附抗原达到精制的目的。(如图1)

二、免疫沉淀实验方案(供实验者参考):
(一)实验材料
试剂及缓冲液:①细胞裂解产物(样品);②ProteinGorProteinAslurry;③一抗;④细胞裂解缓冲液;⑤PBS;⑥SDS-PAGEsamplebuffer;⑦蛋白酶抑制剂
设备:①离心机;②摇床或rotator

(二)实验方法:
A)样品(细胞裂解物)准备
1.收集约107细胞。
(注:1ml体积中所含细胞总数和合适的凝胶上样量取决于不同蛋白以及其抗体的特性)
2.加入约10ml的PBS到锥形管中,并用400×g离心10分钟洗涤细胞。
3.弃去上清液并重复第2步洗涤细胞。
(注:对于细胞培养皿中的单层贴壁细胞,吸除细胞培养液后,用PBS洗涤两次,尽量避免破坏细胞层)
4.完全弃去上清液后,加入1ml预冷的含蛋白酶抑制剂(ProteaseinhibitorCocktail)的细胞裂解液重悬细胞。小心地vortex混匀.
(注:为防止蛋白酶的作用,细胞裂解液应当预冷。所有接下来的操作都在低温条件下进行,并且蛋白酶抑制剂预先添加到细胞裂解液中;此步骤对于细胞培养皿中的单层贴壁细胞,可在10cm的培养皿中加入1ml预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解)。
5.把锥形管或培养皿放在冰上孵育30分钟,并间断性地混匀。
6.4℃,10000×g离心细胞裂解物15分钟。
7.小心地收集上清液转置干净的管中备用;此样品可冻存于-80℃作长期保存。

B)样品的预清洗(可选做)
1.在eppendorf管中加入50ulProteinGbeadslurry,并加入450ul预冷的细胞裂解液。10000×g离心30秒后弃去细胞裂解液;用500ul预冷的细胞裂解液重复洗涤一次,最后用50ul预冷的细胞裂解液重悬微球。
2.把洗涤好的50ulProteinGbead加入到盛有500ul细胞裂解样品的eppendorf管中,于冰上孵育30-60分钟。
3.4℃,10000×g离心10分钟后把上清液转移到新的eppendorf管。若转移过来的上清液中仍含有ProteinGbead,可以再次离心处理后小心地转移上清到另一新的eppendorf管。

C)免疫沉淀
1.在盛有预清洗的细胞裂解样品的eppendorf管中加入5-10ug相应抗体。
(注:抗体的浓度是影响免疫沉淀反应的重要因素;建议实验者进行预实验摸索出合适的使用浓度)
2.4℃孵育1小时。
3.加入50ul预洗的ProteinGbeadslurry(微珠处理参考上面样品的预清洗中第一步方法)。
4.于4℃旋转混匀孵育1小时。
5.4℃,10000×g离心eppendorf管30秒。
6.小心并尽量完全地移除上清液后用500ul的细胞裂解液洗涤微珠3-5次;为减少非特异背景影响,每次洗涤都要尽量小心并完全地移除上清液。
7.最后一次洗涤并弃去上清液后加入50ul的Laemmlisamplebuffer工作液。旋涡混匀后加热至90-100℃十分钟。
8.10000×g离心5分钟,收集上清液。取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。
9.按照电泳说明进行SDS-PAGE电泳。染胶分析沉淀蛋白。
(注:如果接下来用于免疫印迹(WB)分析,则按相应的WB操作步骤继续实验。推荐用eBioscience的TrueBlotTM可以得到更佳WB的效果;WB的抗体使用浓度和免疫沉淀的浓度不同,需视具体情况而定,这里建议应用不同克隆号的抗体。)

三、附录:
(1)缓冲液的制备参考
NP-40CellLysisBuffer:
50mMTris-HclpH8.0
150mMNacl
1%NP-40
ProteaseinhibitorCocktail:
PMSF,5mg(50ug/ml)
Aprotinin,100ug(1ug/ml)
Leupeptin,100ug(1ug/ml)
Pepstatin,100ug(1ug/ml)
100%Ethanolbringupto1ml,aliquot

(2)免疫沉淀(IP)的常见问题及解答

1.用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验?
答:抗体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同,和抗原以及ProteinG或ProteinA的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于IP反应。
一般来说,多抗是沉淀反应最好的选择。另外,纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2.为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶抑制剂?
答:从活性细胞裂解出来的样品中,往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,并且在低温下进行实验。

3.溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么?
答:多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强表面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱表面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合。

4.免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例?
答:每次沉淀实验之前,考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清;缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。

5.免疫沉淀应该如何配制细胞裂解液?
答:适当的细胞裂解液的选择取决于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和;DOC(sodiumde-oxycholate),SDS是离子性的强活性剂。所以裂解液的配制时所用去污剂的种类和浓度以及盐浓度等条件需实验者进行优化。注意如果忘记加TritonX-100,只加DOC或SDS,可能使抗体完全失去活性。

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