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细胞传代

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20130508 打印 字体:  
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1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作者的双手。

2. 将所需的培养基,胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内,点燃酒精灯,将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后,再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次,旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖,分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上,瓶口对准酒精灯,且放在距离酒精灯最近的位置,瓶盖置于酒精灯的另一侧。

3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次,旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次,瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸,在酒精灯消毒2-3次瓶口,竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次,然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液,悬空移入培养瓶内。

4.  将培养瓶平放使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层,计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙,并有1-2个细胞脱落,这时为胰酶消化的最适时机。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度;若看不到针孔样缝隙和细胞脱落,则需继续消化,轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况,可反复几次,直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的最佳消化状态。用移液器将胰酶吸净。

5. 吸取1ml培养基于培养瓶内,并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次,使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次,使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

6. 取2或3个高压后的新培养瓶,瓶口在酒精灯上消毒2-3次,旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧,然后将细胞培养基均匀的分到34个培养瓶内(注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用),进行1314的培养。

7. 拿出1支高压后的5ml定量移液管,在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上,再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次,悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基悬空移入每个培养瓶内,将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放,在瓶身做好实验标记。

8. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧,熄灭酒精灯,整理实验台面,取出实验试剂及污缸等,关闭超净工作台。

9. 将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养,旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水,且定期更换确保无菌。

   每天定时观察细胞生长情况,一般72-96h后,细胞生长密度大于90%,即可进行细胞的传代或保株。

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