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ChIP实验Tips汇总(上),来自英国ChIP实验专家Chromatrap®的分享

作者:admin信息来源:达科为日期:2018年02月09日打印字体:  
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ChIP是一种发展很快的研究技术,主要应用于确定细胞内DNA与蛋白质的相互作用,这一点对正确的基因调控尤为重要。ChIP在表观遗传学领域正被逐渐应用于药物研发中的分子机制研究、分层医学、诊断学以及将ChIP与第二代测序相结合的ChIP-seq技术中。

 

然而ChIP实验难度大,通常会遇到这样或那样的问题:如何确保较好的染色质质量、如何选择合适的片段化方式、超声处理和酶解方法有哪些优缺点、染色质片段化大小哪个范围合适、抗体的选择和设置又有哪些注意的地方?

 

当您在为遇到上述的问题食不知味、夜不能寐、山重水复疑无路时,不妨看看英国ChIP实验专家Chromatrap®提供的Top 10 tips锦囊,或许能柳暗花明又一村!

Tip①  在ChIP实验中,染色质的质量是最重要的一方面,低质量的染色质往往导致不如人意的结果。

一个成功的ChIP实验很大程度上依赖于所制备的染色质的质量。染色质制备最重要的三个方面包括:裂解、交联、片段化。每一个步骤都应该被独立地优化以最佳地还原所研究的生物过程。请阅读以下在染色质制备中的相关技巧。

 

Tip②  实验过程中始终保持染色质在冰上的状态。

染色质在室温保存或处理时极易被降解,且速度非常快。为了防止染色质的快速降解以及获得具有良好可重复性的结果,保证在整个实验过程中染色质一直处于冰上。尽量避免反复冻融,制备完成后独立分装到小管中保存,可以帮助防止染色质的降解。在Chromatrap®提供的试剂盒中,每个IP所需要的染色质是极小量的,因此每一个独立分装的小管样品可以提供多次ChIP实验所需的染色质量。

 

Tip③  避免过度交联细胞,这会导致细胞耐受后续的裂解和片段化。

正如上述提到的,染色质的质量在得到一个好的ChIP结果中起着关键性作用。为了保证较好的染色质的质量,细胞的交联条件需要被不断优化。避免过度交联细胞这一点尤为重要,因为这会导致细胞耐受后续的裂解和超声片段化。过度交联细胞也会影响反交联的效率(即交联效果不能被有效地去除),这会影响后续的实验过程(例如qPCR)。

 

Chromatrap®推荐使用1%的甲醛于培养基或PBS中交联细胞,在室温条件下于旋转混匀器上交联10分钟即可。如果效果依旧不佳,可尝试将交联时间减少至5分钟。

 

Tip④  确保交联过程中使用的溶液现配现用。

交联细胞这一过程会影响所制备的染色质的质量从而影响整个ChIP实验。确保每次制备染色体的过程中使用的甲醛都是现配现用的,这也可以保证实验结果具有更好的可重复性。确保甲醛中没有甲醇的污染,因为甲醇可以破坏细胞膜从而改变交联条件。

 

Tip⑤  根据细胞类型选择合适的片段化方式:超声处理或者酶解。有些细胞可以耐受酶解,因此需要选择超声裂解的方式。

染色质可以通过超声处理(超声波机械断裂)或者酶解(微球菌核酸酶消化)的方式片段化。根据细胞的不同选择合适的片段化方式是十分重要的。Chromatrap®可以依据片段化方法的不同提供相应的试剂盒。我们也可以提供酶解片段化的优化试剂盒。

 

在无法使用超声处理或者为了尽可能减少对可被特异抗体识别的蛋白抗原表位的破坏的情况下,酶解片段化方法十分有效。然而,这种方法具有一定的偏好性,因为核酸酶具有切割特定基因序列的特性。酶解片段化主要应用于非交联染色质免疫沉淀(Native ChIP)实验,在这个过程中,染色质与蛋白质并没有被交联,这时如果采用超声处理来片段化染色质将破坏染色质与蛋白质相互作用形成的复合物。一些细胞种类也许耐受裂解从而导致较差的酶解片段化效率,在这种情况下可以尝试超声处理来同时帮助细胞的裂解以及染色质的片段化。

 

以下列出了超声处理以及酶解片段化的优缺点,供您优化片段化过程中参考从而提高效率。

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