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ChIP实验Tips汇总,来自英国ChIP实验专家Chromatrap®的分享

作者:admin信息来源:达科为日期:2018年02月09日打印字体:  
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ChIP是一种发展很快的研究技术,主要应用于确定细胞内DNA与蛋白质的相互作用,这一点对正确的基因调控尤为重要。ChIP在表观遗传学领域正被逐渐应用于药物研发中的分子机制研究、分层医学、诊断学以及将ChIP与第二代测序相结合的ChIP-seq技术中。

 

然而ChIP实验难度大,通常会遇到这样或那样的问题:如何确保较好的染色质质量、如何选择合适的片段化方式、超声处理和酶解方法有哪些优缺点、染色质片段化大小哪个范围合适、抗体的选择和设置又有哪些注意的地方?

 

当您在为遇到上述的问题食不知味、夜不能寐、山重水复疑无路时,不妨看看英国ChIP实验专家Chromatrap®提供的Top 10 tips锦囊,或许能柳暗花明又一村!

Tip①  在ChIP实验中,染色质的质量是最重要的一方面,低质量的染色质往往导致不如人意的结果。

一个成功的ChIP实验很大程度上依赖于所制备的染色质的质量。染色质制备最重要的三个方面包括:裂解、交联、片段化。每一个步骤都应该被独立地优化以最佳地还原所研究的生物过程。请阅读以下在染色质制备中的相关技巧。

 

Tip②  实验过程中始终保持染色质在冰上的状态。

染色质在室温保存或处理时极易被降解,且速度非常快。为了防止染色质的快速降解以及获得具有良好可重复性的结果,保证在整个实验过程中染色质一直处于冰上。尽量避免反复冻融,制备完成后独立分装到小管中保存,可以帮助防止染色质的降解。在Chromatrap®提供的试剂盒中,每个IP所需要的染色质是极小量的,因此每一个独立分装的小管样品可以提供多次ChIP实验所需的染色质量。

 

Tip③  避免过度交联细胞,这会导致细胞耐受后续的裂解和片段化。

正如上述提到的,染色质的质量在得到一个好的ChIP结果中起着关键性作用。为了保证较好的染色质的质量,细胞的交联条件需要被不断优化。避免过度交联细胞这一点尤为重要,因为这会导致细胞耐受后续的裂解和超声片段化。过度交联细胞也会影响反交联的效率(即交联效果不能被有效地去除),这会影响后续的实验过程(例如qPCR)。

 

Chromatrap®推荐使用1%的甲醛于培养基或PBS中交联细胞,在室温条件下于旋转混匀器上交联10分钟即可。如果效果依旧不佳,可尝试将交联时间减少至5分钟。

 

Tip④  确保交联过程中使用的溶液现配现用。

交联细胞这一过程会影响所制备的染色质的质量从而影响整个ChIP实验。确保每次制备染色体的过程中使用的甲醛都是现配现用的,这也可以保证实验结果具有更好的可重复性。确保甲醛中没有甲醇的污染,因为甲醇可以破坏细胞膜从而改变交联条件。

 

Tip⑤  根据细胞类型选择合适的片段化方式:超声处理或者酶解。有些细胞可以耐受酶解,因此需要选择超声裂解的方式。

染色质可以通过超声处理(超声波机械断裂)或者酶解(微球菌核酸酶消化)的方式片段化。根据细胞的不同选择合适的片段化方式是十分重要的。Chromatrap®可以依据片段化方法的不同提供相应的试剂盒。我们也可以提供酶解片段化的优化试剂盒。

 

在无法使用超声处理或者为了尽可能减少对可被特异抗体识别的蛋白抗原表位的破坏的情况下,酶解片段化方法十分有效。然而,这种方法具有一定的偏好性,因为核酸酶具有切割特定基因序列的特性。酶解片段化主要应用于非交联染色质免疫沉淀(Native ChIP)实验,在这个过程中,染色质与蛋白质并没有被交联,这时如果采用超声处理来片段化染色质将破坏染色质与蛋白质相互作用形成的复合物。一些细胞种类也许耐受裂解从而导致较差的酶解片段化效率,在这种情况下可以尝试超声处理来同时帮助细胞的裂解以及染色质的片段化。

 

以下列出了超声处理以及酶解片段化的优缺点,供您优化片段化过程中参考从而提高效率。

TIP⑥ 确保染色质被片段化到100-500bp的大小,如果染色质没有得到充分片段化或是被过度片段化都会降低ChIP实验的效率。

在每一次染色质制备过程中,确保染色质被片段化至100-500bp是至关重要的。染色质可以通过分光光度计、荧光计以及微流控系统定量分析。样品可以通过琼脂糖凝胶电泳和微流控系统定性分析。Chromatrap®推荐使用最为准确的微流控系统对DNA进行定量,同时Chromatrap®提供的各种缓冲液适配于微流控系统。

 

染色质处理的过程中,如果过度片段化会导致产生的过小片段不利于后续实验的进行,例如在qPCR中,过小的染色质片段会减少引物的识别配对从而影响PCR的效率。由于超声处理所带来的过度片段化同时也会增加破坏蛋白抗原表位的风险。相反地,由于片段化不够充分所产生的大片段染色质则会增加ChIP实验中的非特异性结合的概率。

 

超声处理的效果会因为细胞类型的不同而有所差别,同时样品的交联的程度、超声过程中产生的热量以及乳化作用都会影响超声处理的效果。这些因素都会降低片段化的效率。超声条件的优化对保证一个好的ChIP结果来说十分重要。确保您在超声处理染色质过程中使用的离心管的质地坚硬,这将提高超声波的传递效率。从细胞系或组织样品的富集开始优化是一个不错的选择。这将为您在优化超声的参数条件(包括功率设定、循环次数等)带来更大的弹性空间。在使用Chromatrap®提供的方法时,成功地得到大小在100-500bp之间的染色质片段的推荐条件如下:在4℃冰浴,超声级别为3级的条件下,超声30秒,间隔30秒,共超声15分钟。

对于酶解片段化来说,最重要的因素是细胞膜的裂解和酶的浓度。优化染色质的浓度以确保酶解得到的片段介于100-500bp之间是十分重要的。采用稀释了不同倍数的酶处理染色质以确定适合您的样品的最佳比率。最终选择一个合适的酶浓度并调整酶解时间。在Chromatrap®提供的方法中,每5μg染色质使用1U的酶处理5分钟即可获得最优的片段大小。对于未酶解完全的染色质(400bp及以上),可尝试通过提高U:染色质的比例来提高酶解效率。如果染色质被过度消化成单核小体片段,那么应该减少处理染色质所投入的酶量。

细胞膜的不充分裂解会影响酶对染色质的消化,所以在进行酶解之前建议用相差显微镜检查细胞以确保所有的核都已被释放。如果细胞膜没有被有效地裂解,尝试延长样品在裂解缓冲液中的时间。如果仍然不奏效,那么考虑使用超声的方法裂解细胞。

TIP⑦ 确保您使用的抗体是经过验证表明可以被用于ChIP实验的,因为不是所有的抗体都适用于ChIP。

使用高质量且特异性好的ChIP级别抗体对实验的成功尤为重要。抗体必须识别并且可结合到与DNA结合的内源蛋白。在实验中设置好ChIP验证过的阳性和阴性抗体的对照是十分重要的,这有利于确保染色质制备和ChIP实验过程的正确性。其他用途的抗体不一定适用于ChIP实验。

TIP⑧ 做好抗体的阴性和阳性对照。

为了显示免疫沉淀反应的效率以及确保染色质的制备足够充分,抗体的阴性和阳性对照是必不可少的。Chromatrap®高级版试剂盒中提供针对组蛋白H3的高丰度标记的多克隆抗体,作为阳性对照。同时提供作为阴性对照的IgG。其中还包括优化了的针对qPCR的引物,它可以识别管家基因GAPDH(Barber et al., 2005),以上都是为了确保染色质制备以及ChIP实验过程的无误性。

 

作为选择,一个无引物抗体的空白ChIP反应可用来确定背景的水平。

 

除了设置抗体的阴性和阳性对照,设置阴性和阳性靶基因的对照可以很好地显示抗体的富集是否具有选择性。


TIP⑨ 确定在ChIP实验中所需抗体的量,一般来说,抗体之于染色质应该是过量的。

在一个ChIP实验中,抗体与染色质的比例是十分关键的,错误的抗体与目的蛋白的比例会影响信噪比。过多的抗体会带来饱和现象从而导致非特异性结合。过少的抗体则不能完全结合染色质从而不能代表您的样品的抗体富集程度。磁珠和琼脂糖结合珠子在抗体结合效率方面具有差异性是众所周知的。得益于Chromatrap®的专利固相结合柱,我们可以提供更大的接触表面积从而提高抗体的结合能力以及将非特异的背景降至最低。

在Chromatrap®技术中,每个IP反应所需的染色质是十分微量的(50ng-7μg)。若所加入的染色质量较少,那么抗体与染色质的最佳比例是2:1;若加入的染色质量较多(5μg及以上),那么抗体与染色质的最佳比例是1:1——有利于您节约抗体的使用。为了确定最佳比率,在您的ChIP实验之前进行抗体不同稀释梯度的检测是必不可少的。

TIP⑩ 优化细胞裂解缓冲液的使用量,过多的裂解液会影响抗体的结合。

细胞裂解液通常含有温和的去垢剂。当裂解液被储存在低温时,这些去垢剂很容易从溶液中沉淀析出。为了确保ChIP实验的细胞被充分裂解,在使用裂解液之前建议将其预热至40℃,期间偶尔进行混匀,或者在使用前将裂解液倒置以除去析出物。确保裂解液在使用时温度维持在室温并且所有的析出物均被重新溶解。

 

在染色质的制备过程中,裂解液的体积很关键。细胞数量较少(1-5 million)则需要较小体积的裂解液,细胞数量较多(10-15 million)则需要较大体积的裂解液。过多的裂解液会带来过量的去垢剂从而影响抗体的结合和后续分析(例如qPCR)。过量的裂解液同时也会导致染色体制备的浓度降低。在ChIP实验之前确保裂解液的使用体积对染色质的制备是最优的。

Chromatrap®根据起始细胞数量提供了最优的裂解液体积使用方案,具体见下表:

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